酵素進化工学によるバイオプラスチック生産システムの最適化

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14560285
• 研究機関: 明治大学
• 研究代表者: 田口 精一 明治大学, 農学部, 助教授 (70216828)
• 研究分担者: 前田 理久 , 助教授 (70287887) ; 平石 知宏 理化学研究所, 高分子化学研究室, 研究員 (20321804) ; 高瀬 和真 理工学研究所, 高分子化学研究室, 基礎特別科学研究員 (10342809)
• キーワード: バイオプラスチック / ポリヒドロキシブタン酸 / 重合酵素 / 進化工学 / インビボモニタリングシステム

研究概要

まず、最も生化学的解析が進められているR. eutropha由来重合酵素をモデルターゲットに選定した。進化分子工学の手順を簡単に述べる。最初に、重合酵素遺伝子のみにランダム変異を誘発し、操作性のよい大腸菌を用いて変異体ライブラリーを作製する。次いで、ポリエステル特異的に染色される色素を利用した一次スクリーニング系(プレートアッセイ)と多検体処理可能な定量的HPLC分析(化学変換されたクロトン酸の定量)による二次スクリーニング系に、変異体集団を順次投入し、目的の変異クローンをHPSするというものである。この場合、PHBの細胞内蓄積率とPHB重合酵素活性との間に正の相関が成立するシステムであることが基本であり、PHA蓄積率をモニタリングするだけで目的の高活性酵素を選抜できる「インビボモニタリングシステム」の確立が本システムの中枢である。このストラテジーにしたがい、最近野生型酵素よりも高活性な変異体(2.4倍)を取得することに初めて成功した。実は、高活性をもたらす優良変異の特定には、あるトリックを試みた。通常、野生型酵素から直接進化させる場合、野生型酵素の活性がある程度高いので、野生型酵素と高活性変異酵素の活性を識別することが困難なことが多い。そこで、たとえていうならば、人間(野生型酵素)から度チンパンジーレベル程度に意図的に"先祖返り"させ(活性低下変異)、そこから新たに人間を超越する人工進化(活性復帰変異)をさせ、それを実現させた優良変異を特定するという方法論である。

研究成果

• [文献書誌] T.Kichise, S.Taguchi, Y.Doi: "Enhanced accumulation and changed monomer composition in polyhydroxyalkanoate (PHA) copolyester by in vitro evolution of Aeromonas caviae PHA synthase."Appl. Environ. Microbiol.. 68. 2411-2419 (2002)
• [文献書誌] A.Arisawa, M.Matsufuji, et al., S.Taguchi: "Streptomyces serine protease (DHP-A) as a new biocatalyst capable of forming chiral intermediates of 1,4-dihydropyridine calcium antagonists"Appl. Environ. Microbiol.. 68. 2716-2725 (2002)
• [文献書誌] S.Taguchi, H.Nakamura, T.Hiroishi, I.Yamato, Y.Doi: "In vitro evolution of a polyhydroxybutyrate synthase by intragenic suppression-type mutagenesis"J. Biochemistry. 131. 801-806 (2002)
• [文献書誌] A.Maehara, S.Taguchi, T.Nishiyama, T.Yamane, Y.Doi: "A repressor protein, PhaR, regulates PHA synthesis via its direct interaction with PHA"J. Bacteriol.. 184. 3992-4002 (2002)
• [文献書誌] S.Taguchi, H.Matsusaki, K.Matsumoto et al.: "Biosynthesis of biodegradable coPolyesters from renewable carbon sources by recombinant bacteria"Polymer Internat.. 51. 899-906 (2002)
• [文献書誌] S.Taguchi, K.Arakawa, K.Yokoyama, et al., H.Momose: "Overexpression and purification of microbial pro-transglutaminase from Streptomyces cinnamoneum and in vitro processing by Streptomyces albogriseolus proteases"J. Biosci. Bioengin.. 94. 478-481 (2002)
• [文献書誌] K.Taguchi, S.Taguchi, S.Kume, A.Maehara, T.Tsugi: "Biopolymer Handbook, Vol.3a, Polyesters I, Biological Systems and Biotechnological Production"WILEY-VCH Verlag GinbH. 29 (2002)