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【背景】これまでに我々はインスリン分泌細胞(INS-1)を用いて脱分極刺激による電位依存性Ca^<2+>チャネル(VDCC)からのCa^<2+>流入によるPKCの活性化機構を検討してきた。INS-1細胞においては従来からのPKCの活性化経路であるアセチルコリンやCCKによる経路以外に、脱分極刺激によるVDCCを介したCa^<2+>流入がCa^<2+>依存性conventional PKCだけでなく構造的にCa^<2+>非依存性に活性化されるnovel PKCも活性化することを示した。そこで、今回我々はCa2+流入シグナルによるPKC活性化機構を詳細に解析するため、フォスフォリパーゼC(PLC)の活性化の指標としてイノシトール三リン酸(IP_3)産生を示すPHD(plecstrin homology domain)-GFPとジアシルグリセロール(DAG)産生の指標としてPKC gammaのDAG binding domainであるC1-GFPとをINS-1細胞に過剰発現させ、脱分極刺激を行い各々の局在変化を蛍光顕微鏡及び全反射顕微鏡を用いて検討した。全反射顕微鏡を用いることにより従来の蛍光顕微鏡と比較し10倍以上の蛍光感度でのC1-GFPシグナル検出及び脱分極刺激によるDAG産生量のcalibrationもが可能となった。【方法】INS-1細胞にPHD-GFPおよびC1-GFPを発現させ脱分極刺激(K+ 40mM)による局在の変化と細胞内Ca2+変化を蛍光顕微鏡及び全反射顕微鏡を用いて検討した。PHD-GFPの細胞膜から細胞質への局在変化をPLCの活性化の指標とし、全反射顕微鏡を用いてC1-GFPの細胞膜での蛍光強度の増加をDAG産生の指標とした。また、脱分極刺激のあとにDiC8を投与することによりIn situ calibrationを行った。【結果及び考察】1)PHD及びC1は細胞内Ca2+の増加に伴い局在変化と蛍光強度の増加が観察された2)またこの変化はPLC阻害薬により抑制されることから、Ca^<2+>流入シグナルによるPKCの活性化にはCa2+依存性PLCの関与が示唆された。このCa2+依存性PLCよるDAG増加は2μM程度と推測された。
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