視交叉上核ニューロンにおける[C1^-]_iの周期変動解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570056
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 岡部 明仁 浜松医科大学, 医学部, 助手 (10313941)
• 研究分担者: 鮫島 道和 聖隷クリストファー看護大学, 看護学部, 教授 (80135251) ; 福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
• キーワード: 6-methoxy-N-ethylquinolinium iodide(MEQ) / 視交叉上核(SCN) / Cl^-トランスポーター / Cl^-imaging / [Cl^-]_i / GABA / リズム

研究概要

神経伝達物質であるGABAは、概日リズムの調節にも中心的な役割を果たしていることを示す事が知られている。哺乳動物の時計機構の中枢である視交叉上核(SCN)には網膜-視床下部路を介したGABA作動性の入力が見られる他、外側膝状体-大脳皮質視覚野といった視覚の入力経路においても多数のGABA作動性のニューロンがあり、各神経核の発火頻度の調節をしていると考えられている。こうしたSCN、外側膝状体、大脳皮質視覚野におけるGABAの重要性とともに、SCNニューロンにおいて、昼夜でGABA作用の逆転現象が生じている可能性があるという報告がある。GABA作用の逆転現象とは、抑制性神経伝達物質であるGABAの作用が、細胞内Cl^-濃度([Cl^-]_i)の変化に依存して、抑制作用だけでなく逆に興奮性にも働きうるという説であり、近年注目されている。この現象には、GABA作用を受けるシナプス後ニューロンにおける[Cl^-]_iの変動がキーポイントとなる。SCN、外側膝状体、大脳皮質視覚野のうちイメージング法を用いて主にSCNの神経細胞内Cl^-濃度の昼夜の変動を確認し、加えてCl^-トランスポーターmRNAの発現量が昼夜で変化している傾向が得られた。
1.SCN、外側膝状体、大脳皮質視覚野のCl^-イメージングによる[Cl^-]_iの絶対値の測定[鮫島・福田]
Cl^-感受性蛍光色素の6-methoxy-N-ethylquinolinium iodide(MEQ)の染色方法を改良し、SCNニューロンでの[Cl^-]_iの絶対値の測定を行った。絶対値の測定はnigericin-tributyltinを用いた細胞内外Cl^-濃度固定により[Cl^-]_iの検量線を作成して計算した。事前に昼夜のサイクルに十分エントレインさせたラットからの脳を用い、昼夜で[Cl^-]_iを測定した結果、昼時間帯では約25mM、夜時間帯では約22mMと昼時間帯の方が[Cl^-]_iは高い傾向が得られたが、有意な差は認められなかった。
2.Cl^-ホメオスタシス調節遺伝子の発現変化とその局在のIn Situ Hybridization法による解析[岡部]
細胞内Cl^-濃度の変動を生み出す外向きCl^-トランスポーターとして、KCC2(U55816)、内向きCl^-トランスポーターとしてNKCC(AF051561)の発現を検討した。これらのCl^-ホメオスタシス調節分子mRNAの発現変化とその局在を検討するため、昼時間帯と夜時間帯のSCNにおいて、in situ hybridization組織化学法を用いて解析した結果、KCC2においては変化が認められなかったが、昼時間帯においてNKCC1遺伝子の発現量が増加している傾向が認められた。

研究成果

• [文献書誌] Ueno T, Okabe A, et al.: "Diversity of neuron-specific K^+-Cl^-contransporter expression and inhibitory postsynaptic potential depression in rat motoneurons"Journal of Biological Chemistry. 277. 4945-4950 (2002)
• [文献書誌] Oka T, Akisada M, Okabe A, et al.: "Extracellular serine protease neuropsin (KLK8) modulates neurite outgrowth and fasciculation of mouse hippocampal neurons in culture"Neuroscience Letters. 321. 141-144 (2002)
• [文献書誌] Nabekura J, Ueno T, Okabe A, et al.: "Reduction of KCC2 expression and GABA_A receptor-mediated excitation after in vivo axonal injury"Journal of Neuroscience. 22. 4412-4417 (2002)
• [文献書誌] Kilb W, Ikeda M, Uchida K, Okabe A, et al.: "Depolarizing glycine responses in Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex"Neuroscience. 112. 299-307 (2002)
• [文献書誌] Okabe A, et al.: "Amygdala kindling induces upregulation of mRNA for NKCC1,a Na^+,K^+-2Cl^-cotransporter, in the rat piriform cortex"Neuroscience Research. 44. 223-227 (2002)
• [文献書誌] Wang C, Shimizu, Okabe C, Watanabe K, Okabe A, et al.: "Developmental Changes in KCC1,KCC2,and NKCC1 mRNA expressions in the Rat Brain"Brain Research Developmental Brain Research. 139. 59-66 (2002)
• [文献書誌] Shimizu, Okabe C, Yokokura M, Okabe A, et al.: "Layer-specific expression of Cl^-transporters and differential [Cl^-]_i in newborn rat cortex"Neuroreport. 13. 2433-2437 (2002)