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細胞内カルシウムイオン(Ca^<2+>)は、細胞内情報伝達物質(セカンドメッセンジャー)として広範な細胞機能に関与することが知られており、「細胞や組織の、どこで、いつ、どれくらいCa^<2+>がどんなパターンで変化するのか?」ということが、生体機能を考える上で必須の問題となってきている。
本研究は、このCa^<2+>動態に関与すると考えられている細胞内カルシウム放出チャンネルである1型リアノジン受容体(RyR1)を特異的に阻害できる優性阻害ドミナント・ネガティブ実験系の開発を目的とした。
方法は、全長約5千個のアミノ酸から成るRyR1をコードするcDNAを約10分の1毎のサイズに分割して利用できるカセット構造化して、アミノ酸4032番目のグルタミン酸をアラニンに変異させたRyR1クローン(E4032ARyR1)を作製した。さらにE40321ARyR1クローンをEGFP融合蛋白質として発現することで個々の生細胞レベルでその発現の有無を可視化できる仕様(E4032ARyR1-EGFP)とした。
野生型(wt)RyR1単独をトランスフェクトした培養細胞では、幾つかの細胞においてRyR1刺激薬によって細胞内Ca^<2+>上昇が見られたが、GFP蛍光を発するE4032ARyR1-EGFP単独をトランスフェクトした細胞では細胞内Ca^<2+>上昇が見られなかった。さらに、wtRyR1とE4032ARyR1-EGFPの共発現した場合、GFP蛍光を発しない細胞の幾つかにおいては顕著な細胞内Ca^<2+>上昇が見られるのに対して、GFP蛍光を発するすべての細胞では細胞Ca^<2+>上昇がほとんど見られなかった。
以上の結果より、変異体E4032ARyR1は、個々の生細胞レベルで認識可能なEGFP融合蛋白質して共発現させることにより、wtRyR1のCa^<2+>放出能を特異的に阻害できるドミナント・ネガティブとなることが示された。
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