解糖系酵素異常における赤芽球アポトーシス亢進のメカニズムに関する研究

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570131
• 研究機関: 東京女子医科大学
• 研究代表者: 菅野 仁 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (70221207)
• 研究分担者: 相沢 信 日本大学, 医学部, 教授 (30202443)
• キーワード: 溶血性貧血 / 赤血球 / フレンド細胞 / RNAi / アイソザイム

研究概要

CBA系マウス純系コロニー内に自然発生した溶血性貧血マウス(pk-1^<slc>)はヒトピルビン酸キナーゼ(PK)異常症のモデルマウスである。このマウスから樹立したフレンド細胞株SLC3は赤血球(R)型PK遺伝子の点突然変異を有し、継代中にアポトーシスを惹起することから、R-PKが赤芽球におけるアポトーシス抑制に関与していることが示唆されている。今年度はCBA系野生型マウスより樹立したフレンド細胞CBA2を用いて、RNA interference(RNAi)法によるR-PK遺伝子発現抑制がアポトーシスを誘発するかどうか検討を加えた。
pSilencer1.0-U6ベクターにマウスR型PKmRNAのNo.390〜408までの19塩基対を標的とした二重鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、リポソーム法を用いてCBA2細胞への遺伝子導入を行なった。遺伝子導入後48時間後からG418を400μg/mlを加えた培地に変更して、耐性を獲得した細胞を得た。RNAiによるマウスR-PK遺伝子発現の低下は、R型PKに特異的な抗PK抗体によるウェスタンブロット解析で確認した。R-PK発現が低下したフレンド細胞株には、1)細胞形態、2)DNAラダーの出現、3)SubG_0/G_1期細胞の増加などのパラメーターにより、アポトーシスの誘発が確認された。対照としてpIRES2EGFPを導入したCBA2細胞には上記の変化が観察されなかったため、これらのアポトーシス形質の獲得は、遺伝子導入操作による非特異的な現象ではなく、RNAiによるR-PK遺伝子発現の低下によるものと結論した。

研究成果

• [文献書誌] Kanno, H. et al.: "Homozygous intragenic deletion of type-I hexokinase gene causes lethal hemolytic anemia of the affected fetus"BLOOD. 100. 1930 (2002)
• [文献書誌] Kanno, H. et al.: "Physiological significance and molecular genetics of red cell enzymes involved in the ribonucleotide metabolism"Proc Jpn Acad. 78. 287-292 (2002)
• [文献書誌] Murakami, K. et al.: "Gene expression and biological Significance of hexokinase in erythroid cells"Acta Haematologica (Basel). 108. 204-209 (2002)
• [文献書誌] Sakimoto, T. et al.: "A novel nonsense mutation with a compound heterozygous mutation in TGFBI gene in lattice corneal dystrophy type I"Jpn J Ophthalmol. 47. 13-17 (2003)