遺伝子改変ラット肺血管内皮細胞株を用いた生体バリアの再構成と制御機構の解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570196
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 千葉 英樹 札幌医科大学, 医学部, 講師 (00295346)
• 研究分担者: 澤田 典均 札幌医科大学, 医学部, 教授 (30154149)
• キーワード: タイト結合 / クローディン / 血液脳関門 / 血液組織関門 / MAPキナーゼ / サイクリックAMP / プロテインキナーゼA / 血管内皮細胞

研究概要

血管内皮細胞間をシールするタイト結合は血液組織関門に必須であり、その破綻は脳浮腫や癌の血管外脱出等さまざまな病態の原因や修飾因子となると考えられている。血管内皮には多くのタイト結合構成分子が発現しているが、血液組織関門の形成や制御の分子メカニズムはよく分かっていない。我々は、ブタ血液脳関門(BBB)内皮細胞を用いて、cyclic AMP(cAMP)によるプロテインキナーゼA(PKA)活性化が内皮特異的タイト結合分子claudin-5のリン酸化を誘導し、cAMPがPKA非依存性にclaudin-5の遺伝子発現を増加させ、内皮バリアを亢進することを明らかにした。また、claudin-5のC末細胞内領域にPKAのリン酸化候補部位(RRPT^<207>)を見出し、野生型及び変異型claudin-5の発現を誘導できるラット肺血管内皮(RLE)細胞株を樹立した。その結果、claudin-5の発現によって分子サイズ選択的な内皮バリアが再構成されること、PKAがclaudin-5のThr^<207>を標的として内皮バリアを制御することを明らかにした。一方、MAPキナーゼも血管内皮や上皮のバリア機能を調節することが知られているが、その標的分子は明らかではない。我々は、claudin-1のC末細胞内領域にMAPキナーゼのコンセンサスリン酸化部位(PKPT^<203>P)を見出し、野生型及び変異型claudin-1の発現を誘導できるRLE細胞株を樹立した。この培養系を用いて、生理的レベルのMAPキナーゼはclaudin-1のThr^<203>をリン酸化させ、タイト結合のバリア機能を増強することを明らかにした。また、claudin-1とclaudin-5では、機能的に異なる内皮バリアが再構成されることを示した。我々が樹立した遺伝子発現誘導系は、血管内皮における生体分子の機能を解析する上で有用な武器となると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Osanai M et al.: "Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α induces expression of endothelial Fas ligand (FasL) to prevent cancer cell transmigration : a novel defense mechanism of endothelium against cancer metastasis"Jpn J Cancer Res.. 93. 532-541 (2002)
• [文献書誌] Kamimura Y et al.: "Barrier function of microvessels and roles of glial cell line-derived neurotrophic factor in the rat testis"Med Electron Microsc.. 35. 139-145 (2002)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Cx32 formation and/or Cx32-mediated intercellular communication induce expression and function of tight junctions in hepatocytic cell line"Exp Cell Res.. 276. 40-51 (2002)
• [文献書誌] Takakuwa Y et al.: "Bile canalicular barrier function and expression of tight junctional molecules in rat hepatocytes during common bile duct ligation"Cell Tissue Res.. 307. 181-189 (2002)
• [文献書誌] Miyahara T et al.: "A highly potent 26,27-hexafluoro-1α,25-dihydroxyvitamin D_3 on calcification in SV40-transformed human fetal osteoblastic cells"Calcif Tissue Int.. 70. 488-495 (2002)
• [文献書誌] Chiba H et al.: "Hepatocyte nuclear factor (HNF)-4α triggers formation of functional tight junctions and establishment of polarized epithelial morphology in F9 embryonal carcinoma cells"Exp Cell Res.. 286. 288-297 (2003)
• [文献書誌] Ishizaki T et al.: "Cyclic AMP induces phosphorylation of claudin-5 immunoprecipitates and expression of claudin-5 gene in blood-brain-barrier endothelial cells via protein kinase A-dependent and -independent pathways"Exp Cell Res.. 290. 275-288 (2003)
• [文献書誌] Sawada N et al.: "Tight junctions and human diseases"Med Electron Microsc.. 36. 147-156 (2003)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Regulation of the blood-biliary barrier : interaction between gap and tight junctions in hepatocytes"Med Electron Microsc.. 36. 157-164 (2003)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Role of the p38 MAP-kinase signaling pathway for Cx32 and claudin-1 in the rat liver"Cell Commun Adhes.. 10. 437-443 (2003)
• [文献書誌] Kojima T et al.: "Inhibition of MAP-kinase activity moderates changes in expression and function of Cx32 but not claudin-1 during DNA synthesis in primary cultures of rat hepatocytes"Med Electron Microsc.. (in press).
• [文献書誌] Fujibe M et al.: "Thr^<203> of claudin-1, a putative phosphorylation site for MAP kinase, is required to promote the barrier function of tight junctions"Exp Cell Res.. (in press).
• [文献書誌] 千葉英樹: "培養細胞における新しい遺伝子ノックアウト法"実験医学別冊クローズアップ実験法総集編. 49-53 (2002)
• [文献書誌] 千葉英樹: "新世代の遺伝子ターゲティング"病気と分子細胞生物学-ゲノムと分子でわかるヒトの病気. 140-147 (2002)
• [文献書誌] 千葉英樹: "転写因子の分子生物学と疾患"病気と分子細胞生物学-ゲノムと分子でわかるヒトの病気. 172-178 (2002)
• [文献書誌] 千葉英樹: "核内レセプターの転写制御と疾患"病気と分子細胞生物学-ゲノムと分子でわかるヒトの病気. 180-190 (2002)
• [文献書誌] 千葉英樹: "幹細胞と再生医学"病気と細胞内小器官-細胞から病気のしくみを理解する. 206-213 (2002)