ウエルシュ菌イオタ毒素の分子生物学的分析と結晶解析による作用発現機構の解明

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570251
• 研究機関: 徳島文理大学
• 研究代表者: 桜井 純 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (80029800)
• 研究分担者: 小林 敬子 徳島文理大学, 薬学部, 助手 (90170315) ; 永浜 政博 徳島文理大学, 薬学部, 助教授 (40164462)
• キーワード: ウエルシュ菌 / イオタ毒素 / 二成分毒素 / ADPリボシル化 / オリゴマー / リピッドラフト / エンドサイトーシス / エンドソーム

研究概要

ADPリボシル化酵素の共通モチーフ以外の残基でla成分の触媒Cavity内、また、での周辺に存在するアミノ酸残基をアミノ酸置換して、それぞれの酵素活性のカイネティク分析を行い、アミノ残基の役割を解析した。Y-246は、アクチンへのADPリボシル部の転移、Y-251は、NAD+のCavity内への導入、N-255は、アクチンの認識、E-301は、触媒部位の構造維持、F-349は、NAD+のニコチンリングの固定、R-352は、NAD+のリン酸基の固定に働いていることを明らかにした。次に、la成分のlb成分との結合は、その立体構造を考慮し、lb成分を支持体に固定してBiacore分析すると、種々の変異la成分との結合の比較から、la成分の191-210残基領域あることが明らかとなった。lbをVero細胞とインキュベーション後、1%Triton X-100処理と不連続スクロース密度勾配超遠心法によって分析すると、lbは、Vero細胞のラフトに結合して7量体オリゴマーを形成することが判明した。Cy3ラベルlbの細胞への結合と侵入を蛍光顕微鏡で検討すると、Cy3ラベルlbは、時間に伴い細胞膜側からエンドソーム内への移行が認められ、抗lb抗体を用いた蛍光抗体法による解析でも、同様に、細胞内への侵入が認められた。加えて、lbの存在下、非存在下におけるNドメインと蛍光タンパク質であるGreen Fluorescent Protein(GFP)との融合タンパク質(laN-GFP)の解析によって、laは、lbと結合してエンドサイトーシスにより細胞内に侵入することが判明した。以上の結果から、イオタ毒素は、lbがVero細胞のラフトに存在するレセプターに結合後、オリゴマーを形成、そこにlaのNドメインが結合し、エンドサイトーシスにより細胞内に侵入して初期エンドソームへ移行、最終ステップとして、laが細胞質に遊離してアクチンをADPリボシル化すると推察される。

研究成果

• [文献書誌] M.Nagahama, S.Hayashi, S.Morimitsu, J.Sakurai: "Biological activities and pore-formation of Clostridium perfringens beta-toxin in HL 60 cells"J.Biol.Chem.. 278. 36934-36941 (2003)
• [文献書誌] S.Ochi, M.Oda, M.Nagahama, J.Sakurai: "Clostridium perfringens alpha-toxin-induced hemolysis of horse erythrocytes is dependent on Ca^<2+> uptake"Biochim.Biophys.Acta. 1613. 79-86 (2003)
• [文献書誌] J.Sakurai, M.Nagahama: "Mechanism of action of Clostridium perfringens beta-toxin"Recent Res.Devel.Infection & Immunity. 1. 433-449 (2003)
• [文献書誌] J.Sakurai, M.Nagahama, J.Hisatsune, H.Tsuge, J.Sakurai et al.: "Clostridium perfringens iota-toxin, ADP-ribosyltransferase : the structure and the mechanism of action"Advan.Enzyme.Regul.. 43. 361-377 (2003)
• [文献書誌] H.Tsuge, M.Nagahama, H.Nishimura, N.Katunuma, J.Sakurai et al.: "Crystal structure and site-directed mutagenesis of enzymatic component from Clostridium perfringens iota-toxin"J.Mol.Biol.. 325. 471-483 (2003)
• [文献書誌] M.Nagahama, S.Morimitsu, A.Kihara, J.Sakurai et al.: "Involvement of tachykinin receptors in Clostridium perfringens beta-toxin-induced plasma extravasation"Br.J.Pharmacol.. 138. 23-30 (2003)
• [文献書誌] 櫻井純, 本田武司, 小熊恵二: "細菌毒素ハンドブック"(株)サイエンスフォーラム. 587 (2002)