サルモネラリピドAのマクロファージ活性化における種特異性を支配する分子機構の解明

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570256
• 研究機関: 国立医薬品食品衛生研究所
• 研究代表者: 棚元 憲一 国立医薬品食品衛生研究所, 部長 (60107430)
• 研究分担者: 大西 貴弘 国立医薬品食品衛生研究所, 研究員 (30321855) ; 室井 正志 国立医薬品食品衛生研究所, 室長 (70311389)
• キーワード: エンドトキシン / LPS / 動物種特異性 / TLR4 / MD2 / サルモネラリピドA / CD14

研究概要

サルモネラリピドAの動物種特異的反応にはMD-2が関与することは前年度に明らかにしたが、今年度はLPSのシグナル伝達におけるCD14の動物種差を明らかたするため、TLR4とTLR2を介するNF-κBの活性化に必須なマウスCD14分子の機能的部位を探索した。マウス由来のTLR4/MD-2またはTLR2を発現させた293細胞にさらにマウス由来の野生型CD14を発現させると、LPSまたはPEX刺激によるNF-κB依存性のレポーター活性が増強される。野生型の代わりに35-44、144-153、235-243、270-275のアミノ酸をそれぞれ欠失したCD14欠失変異体(d35-44、d144-153、d235-243、d270-275)を発現させるとTLR4/MD-2を発現させた293細胞での増強作用を示さなくなった。TLR2を発現させた293細胞でもd35-44とd235-243は増強作用を示さなかったが、d144-153とd270-275は野生型と同等な活性を示した。TLR4/MD-2を介する活性化においてd144-147は野生型と同等な活性を示すが、d151-153では活性が全く見られなかった。151から153のアミノ酸を全てアラニンに置換した変異体(151-153A)でもほとんど活性を示さなかった。一方、270から272までをアラニンに置換した変異体は野生型と同等な活性を示したが、273から275をアラニンに置換した変異体(273-275A)には活性が見られなかった。ヒト由来のCD14は151以降のアミノ酸を欠失しても野生型と同等なTLR4/MD-2を介する活性を有するにもかかわらず、マウス由来のCD14は151以降のアミノ酸を欠失すると活性が消失した。d35-44、151-153A、d235-243および273-275Aの細胞膜上への発現能およびTLR4との結合能は野生型と同等であった。これらの変異体のTLR4/MD-2へのシグナル伝達能はphotoreactiveなLPSのCD14変異体、TLR4、MD-2への結合能と平行した。以上より、ヒトとマウスのCD14ではLPSのシグナル伝達においてC末側の要求性という点で異なっていること、さらに、TLR4/MD-2またはTLR2を介するNF-κBの活性化にはマウスCD14の異なる領域が必要であり、35-44、151-153、235-243および273-275のアミノ酸がLPSとの結合およびTLR4/MD-2へのLPSの受け渡しに重要な役割を果たしていることが明らかとなった。昨年度からの結果を含めて、CD14、TLR4、MD-2といった分子全てがエンドトキシンの糖鎖部分も含めた構造認識に関わり、これを識別するものと考えられる。今年度はさらにLPS試料中に、peptidoglycanやリポ蛋白とは異なるTLR2刺激性エンドトキシン様の物質が含まれていること、MD-2がLPS認識に加えTLR4の機能発現にも必須であること等、LPS生体作用の分子機構に重要な幾多の成果を上げた。

研究成果

• [文献書誌] Sugimoto N.: "Analysis of constituents in Jamaica Extract, a natural bittering agent."J.Food Hyg.Soc.Japan. 44(6). 328-331 (2003)
• [文献書誌] Mustuga M.: "Analytical method for formaldehyde, acetoaldehyde and PET cyclic oligomers in polyethylene terephthalate products."Japanese Journal of Food Chemistry. 10(3). 138-144 (2003)
• [文献書誌] Sato K.: "Structure determination of minor red pigment in carthamus red colorant isolated by preparative LC/MS."Food Addit Contam.. 20(11). 1015-1022 (2003)
• [文献書誌] Muroi M: "Lipopolysaccharide-mimmeric activities of Toll-like-receptor 2-stimulatory substance(s) contained in Escherichia coli lipopolysaccharide preparations."Infect.Immun. 71(6). 3221-3226 (2003)
• [文献書誌] Ohnishi T: "N-linled glycosylation critical to the Toll-like receptor 4 function require the presence of MD-2."Clin.Diagn.Lab.Immunol.. 10(3). 405-410 (2003)
• [文献書誌] Sakai A.: "Overexpression of NP95 mRNA by tumor promoters in the promotion phase of a two-stage BALB/3T3 cell transformation assay."Biol.Pharm.Bull.. 26(3). 347-351 (2003)
• [文献書誌] 佐々木次雄: "製薬用水の製造及び品質管理に関する調査研究"医薬品研究. 34(11). 703-716 (2003)
• [文献書誌] Fujihara M.: "Molecular mechanisms of macrophage activation and deactivation by lipopolysaccharide : roles of the receptor complex."Pharmacol Ther.. 100(2). 171-194 (2003)
• [文献書誌] Ogawa Y.: "Estrogen receptor binding activities of UV stabilizer used in food contact plastics and benzophenone derivatives."J.Health Sci.. 49(3). 205-212 (2003)
• [文献書誌] Abe Y.: "Material labeling of soft toys and plasticizers in poluvinyl chloride products."J.Food Hyg.Soc Japan. 44(3). 168-174 (2003)
• [文献書誌] Kawasaki Y: "Determination of six p-hydroxybenzoic acid esters in laver (Nori) by HPLC."Bull.Natl.Inst.Health Sci.. 121. 48-50 (2003)
• [文献書誌] 大西貴弘: "Toll-like receptor 4の膜発現に重要なN-グリコシル化におけるMD-2の役割 エンドトキシン研究6"医学図書出版. 31-35 (2003)
• [文献書誌] 室井正志: "Toll-like receptor 4を介するNF-κBの活性化に必須なマウスCD14分子の機能的部位 エンドトキシン研究6"医学図書出版. 136-143 (2003)