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本研究において以下のような結果が得られた
1.親子鑑定・個人識別に繁用されている遺伝的多型poly marker検出システムPMキット(Applied Biosytems)で検出することのできるLDLR、GYPA、HBGG、D7S8、GCについてallele specific TaqManPCR法による検出法を構築した。各座位の塩基配列を基にプローブ、プライマーを設計し、PMキットの結果と比較しながら最適な組み合わせを選択した。SYBR Green Iを用いる変法においても各座位の判定を行うことができた。また、GYPAについてはプライマー及びプローブの部位を変えた系についても検討しMN式血液型genotyping法を構築した。
2.ABO式血液型糖転移酵素cDNAの261番の欠失の有無、703番、796番及び930番における塩基置換を識別できるMGBプローブを用いたTaqMan PCR法によるABO式血液型genotypingの系を構築することができた。
3.ABO式血液型糖転移酵素cDNAの261番における欠失の有無、796、803番の塩基置換について融解曲線分析による検出法を構築した。蛍光色素標識変異プローブと変異のない領域にハイブリする蛍光標識アンカープローブを混和し、反応液の温度を徐々に上昇させ、変異の有無による変異プローブの解離を蛍光強度モニタリングによって検出し、261番においてはAA・AO・OOを、796、803番においてはBB及びAB・BOを識別することができた。
4.ミスマッチプライマーを用いたMN式血液型genotypingについて検討した。M型にマッチしたprimerを設計し、PCRの立ち上がりのサイクル数の遅れを解析することにより、MM型、NN型、MN型を識別する系を構築した。NN型では反応が遅いサイクル数から立ち上がり、MM型、MN型明瞭に区別できた。MM型とMN型の立ち上がりの差は1サイクル程度であり、正確な判定のために、β-globinによる標準化を行ったところ、サンプル10ng当たりのコピー数の(GYPA/β-globin)値は、MN型では1前後、MN型では0.4前後となり、MM型、NN型、MN型を識別できた。更にGYPA遺伝子のexon2の22番目の塩基の置換を識別する融解曲線分析法によるMN式血液型genotyping法を構築することができた。
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