リボザイム、カタリチックDNAを用いたSOD変異によるALSの遺伝子治療

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14570582
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 横田 隆徳 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (90231688)
• 研究分担者: 水澤 英洋 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (30144091)
• キーワード: リボザイム / DNAエンザイム / siRNA / SODI / ALS / カタリテックDNA / RNAi / アデノウイルスベクター

研究概要

近年、特定連伝子の発現を抑制する方法として、antisense、ribozyme、DNA enzymeに加えて、RNA干渉現象を利用したshort interference RNA(siRNA)が開発され注目を浴びている。今回、siRNAのSOD1遺伝子G93Aの点変異を認識する配列特異性とその発現抑制効果を培養細胞上でribozyme, DNA enzymeと比較検討した。
G93Aの点変異を認識して変異SOD1遺伝子の発現を特異的に抑制するsiRNAのデザインに成功した。点変異の位置を5'末端から10-13塩基目にデザインすると最も有効に点変異を羅織できた。
同一のSOD1 mRNAの基質部位に対してsiRNA, ribozymeやDNA enzymeをデザインした。ribozymeやDNA enzymeはin vitro転写によるin vitroでの切断実験で切断効率は90%以上の有効なものを作製し得た。これらを用いて培養細胞系でその効率効率を同部位にデザインしたsiRNAと比較検討すると特に内因性のSOD1の発現抑制においてsiRNAはribozymeやDNA enzymeよりはるかに有効であった。
さらに有効なsiRNA配列をDNAベクターに組み込んで発現型siRNA DNAベクターを構築した。プロモー夕ーはtRNAよりU6の方が優れており、siRNA配列はtandem型よりstem型の方が優れていた。このU6プロモーター下stem型siRNA配列をアデノウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターに組み込みその効果も培養細胞系では確認した。
今回作製したSOD1遺伝子変異に特異的なsiRNAは、家族性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の遮伝子治療への第1ステップになり得たと考えられる。

研究成果

• [文献書誌] YOKOTA T, et al.: "siRNA-based inhibition specific for mutant SODI with single nucleotide alternation in familial ALS, compared with ribozyme and DNA enzyme"Biochemical and Biophysical Research Communication. 314. 283-291 (2004)
• [文献書誌] 横田隆徳: "RNAiによる神経変性疾患の遺伝子治療をめざして"遺伝子医学. 7・3. 349-354 (2003)
• [文献書誌] 横田隆徳: "RNAiの医療への応用"実験医学. 22・4. 485-491 (2004)
• [文献書誌] Li Y, et al.: "siRNA-based inhibition of Mutant ataxin3 gene expression : potential use for gene therapy of Machado-Joseph disease"Annals of Neurology. (印刷中).
• [文献書誌] Yokota T, et al.: "Inhibition of intracellular hepatitis C rims replication by synthetic and vector-drived small interfering RNAs"EMBO report. 4・6. 602-608 (2003)
• [文献書誌] Ykota T, et al.: "Down regulation of DJ-1 enhances cell death by oxidative stress, ER stress, and proteasome in inhibition"Biochemical and Biophysical Research Communication. 312. 1342-1348 (2003)