| 研究概要 |
我々は以前、ヒト神経芽細胞腫細胞とマウスの骨髄細胞との共存培塞を行い、この共存培養下で破骨細胞が形成されること、また破骨細胞誘導因子であるRANKLの発現が上昇していることを報告した。そこで、RANKLに対するデコイ受容体であるosteoprotegerin(OPG)を用いて、神経芽細胞腫骨転移マウスモデルに対する治療を試みることとした。まず、OPG発現ベクターの筋肉内遺伝子導入法を行うため、ラット腎臓より得たcDNAを鋳型として蛋白コード領域をPCRクローニングし、種々の細胞で高発現が得られるpCAGGSに組み込み、さらにタグとしてOPGのC端にFLAGを付加した。作製したratOPG-FLAGをCOS7細胞に導入して培養上清を回収し,発現は抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、破骨細胞形成に対する阻害活性はin vitroの破骨細胞形成実験により確認した。次に動物の筋肉内に遺伝子導入した際の、発現及び分泌、骨吸収抑制作用を検討するため、PTHrP産生腫瘍をヌードラットに移植した腫瘍随伴性高カルシウム血症動物モデルに対してpCAGGS-ratOPG-FLAGの筋肉内遺伝子導入を行った。その結果、遺伝子導入後1週間以内に高カルシウム血症の是正を認めた。抗FLAG抗体を用いたWestern blotで、遺伝子導入を行った動物の血清中にはratOPG-FLAGの存在が確認された。しかし、ratOPGに対するアッセイ系がavailableではないため、新たにヒト骨芽細胞株よりhuman OPG cDNAをクローニングし、pCAGGSに組み込んだ(pCAGGS-humanOPG)。哺乳類細胞における発現及び破骨細胞形成阻害活性については確認したので、現在、マウス筋肉内へのpCAGGS-humanOPG遺伝子導入を行い、血中への分泌についてELISAによる検討を行っている。
|
