| 研究課題/領域番号 |
14570809
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
藤本 亘 川崎医科大学, 医学部, 教授 (50165429)
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| 研究分担者 |
幸田 衞 川崎医科大学, 医学部, 助教授 (50153474)
山口 雅英 川崎医科大学, 医学部, 講師 (60299196)
大森 謙太郎 川崎医科大学, 医学部, 講師 (20278930)
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| キーワード | グルココルチコイド受容体 / real-time RT-PCR / 自己免疫性水疱症 |
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| 研究概要 |
Real-time RT-PCR法による定量的解析法は、従来の比較RT-PCR法や競合RT-PCR法などの半定量的解析法とは異なり、蛍光色素でラベリングされたターゲット特異的プローブを用いることで、完全な定量的解析が可能な方法である。本年度は、グルココルチコイド受容体研究の基本部分を確立する目的で、健常人および自己免疫疾患患者の末梢血におけるグルココルチコイド受容体発現をreal-time RT-PCR法を用いて検討した。まず健常人ボランティアおよび患者末梢血からtotal RNAを抽出、精製し、既に報告されているプライマー配列を用いて半定量的RT-PCR法を行った。結果、健常人末梢血中のグルココルチコイド受容体α(GRα)およびβ(GRβ)mRNAの発現量は従来の報告どおりGRαに比べGRβの発現量が圧倒的に少ないことが確認できた。
続いて、ターゲット特異的プローブ、3種類のプライマーを作製し、同サンプルを用いてそれぞれrealtime RT-PCR法を行ったところGRαとGRβmRNAはほぼ同等量発現している結果が得られ、前述の半定量的RT-PCR法の結果を再現し得なかった。
real-time RT-PCR法のPCR条件は一般的な条件とは大きく異なり、増幅条件を最適化しPCRの効率と特異性が最大限になるように設定する必要がある。今回、それぞれで得られた検量線は必ずしも最適ではなく、効率よく特異的な増幅反応が行われていない可能性がある。現在、より最適な増幅反応が行えるようプライマー設計、PCR条件などを検討中である。
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