| 研究概要 |
初期の血栓形成においてはGPIbとVWFとの相互作用が重要であり、三次元構造を保持した状態でのGPIbαとVWFの結合形式を検討することが必要である。我々はGPIbαのN末端フラグメントのC末端にFLAG-tagを付け、これをHEK293T細胞で発現/回収、これを抗FLAG抗体で固層化した後ラベルしたVWFとの結合性を評価した。さらにマウスVWFゲノム遺伝子のA1ドメインを含む断片を単離、K599がノックインされたマウスの作成を行った。
1 128,172-175がVWF binding soteであることが確認され、4、6番目のleucine rich repeats domain (LRR) VWF bindingに重要であった。
2 VWF-GPIba複合体の立体構造に当てはめた結果VWF Lys599の側鎖がGPIbaに向かって深く埋没していることが明らかになり、本研究においてノックイン作成をすすめてきたLys599の意義が明らかになった。
3 129SVJマウスのゲノムライブラリー(STRATAGENE社製)からすでに明らかになっているマウスVWFのexon28(A1 domainをふくむ)のシークエンスをkeyにマウスVWFゲノム遺伝子のA1ドメインを含む断片を単離、得られたマウスVWF geneをもとにloxP配列によって囲まれたネオマイシン耐性遺伝子(MC1-neo)とジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子(PGK-DTA)によるポジティブ・ネガティブセレクション用のターゲティングベクターを作成し、あわせてVWF当該領域(Al domainに含まれる)に対してsite-directed mutagenesisを行ってK599Aのmutationを導入した。これをエレクトロポレーションによりES細胞(D3細胞)に導入、G-418により選択培養し、PCRおよびサザン解析して相同組換え体の単離・同定を行っている。得られたクローンはC57BL/6Jマウスより採取した胚盤胞に注入し、仮親の子宮に移植、生まれたキメラマウスをICRマウスと交配し、変異アレルの伝搬を調べてヘテロマウスを抽出する。これをCre-recombinaseを発現するCAG Cre mouseと交配させ、Cre-recombinaseによりloxP配列で挟まれたNeoR遺伝子がexcisionされたものをPCRによって選別した
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