造血幹細胞と株細胞から血小板代替物を製造する培養システムの開発

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14571000
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 池淵 研二 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (20175194)
• キーワード: 血小板 / 代替物 / 巨核球系細胞株 / 骨髄ストロマ / ヒト臍帯血 / CD34陽性細胞 / SCIDマウス

研究概要

ヒト造血幹細胞および前駆細胞を体外で増幅するためのシステム開発を試みた。テロメラーゼ遺伝子導入ストロマ細砲はヒト造血を支持した。これを生きたまま利用する場合、系の再現性、安定性が悪いため、固定して用いることを検討した。グルタルアルデヒド固定は細胞増幅を支持し、検討した期間(4週間)は冷蔵で保存可能であることを明らかにした。
ヒト巨核球系細胞株MEG-Jを用い血小板様粒子産生過程を検討した。分化誘導剤(TPA、フォスファターゼ阻害剤など)添加にて、細胞の大型化、多倍体化は亢進したが、アポトーシス細胞が増加した。血清添加の高密度培養にて血小板用粒子産生が高まった。低速遠心分離およびパーコールを用いた比重遠心法にて粒子を回収し、粒子が血小板糖タンパクGPIIb/IIIa陽性、GPIb陰性であることを確認した。一部の粒子はアネキシンV陽性であり、アポトーシス小体である可能性が残った。
ヒト臍帯血CD34陽性細胞を培養しCD41陽性巨核球系細胞の増幅を行なった。サイトカインTPO+SCFで2週間培養する系が最適であり、約100倍に増幅できた。細胞の成熟を誘導するためTPO単独添加培養を3〜7日間追加するも、アポトーシス細胞が増加した。血小板様粒子の産生は極めて少数であった。
生体投与系を確立するため、SCIDマウスにヒト血球を輸注するシステムを検討した。抗アシアロGM1抗体を腹腔投与した後、ヒト好中球を静注し、経時的にマウス末梢血中のヒト血球の比率をFCMで測定した。静注後15分、60分にはヒト細胞が検出できた。この系を培養血球の生体適合性を検討するシステムとして採用する。

研究成果

• [文献書誌] Ito Y, Hasuda H, Yamauchi T, Komatsu N, Ikebuchi K: "Immobilization of erythropoietin to culture erythropoietin-dependent human leukemia cell line."Biomaterials. 25(12). 2293-2298 (2004)
• [文献書誌] Hirayama F, Yamaguchi M, Yano M, Yasui K, Horie Y, Matsumoto K, Nagao N, Ikebuchi K, Azuma H, Ikeda H, Tani Y: "Spontaneous and rapid reexpression of functional CXCR4 by human steady-state peripheral blood CD34+cells."Int J Hematol. 78(1). 48-55 (2003)
• [文献書誌] Kuwahara I, Ikebuchi K, Hamada H, Niitsu Y, Miyazawa K, Ohyashiki K, Fujisawa_H, _Furukawa_K: "Changes in N-glycosylation of human stromal cells by telomerase Expression."Biochem Biophys Res Commun. 301(2). 293-297 (2003)
• [文献書誌] Kawano Y, Kobune M, Yamaguchi M, Nakamura K, Ito Y, Sasaki K, Takahashi S, Nakamura T, Chiba H, Sato T, Matsunaga T, Azuma H, Ikebuchi K, Ikeda H, Kato J, Niitsu Y, Hamada H: "Ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitor cells using a coculture system with human telomerase catalytic subunit(hTERT)-transfected human stromal cells."Blood. 101(2). 532-540 (2003)