| 研究課題/領域番号 |
14571024
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
守山 敏樹 大阪大学, 健康体育部, 講師 (30283815)
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| 研究分担者 |
安東 明夫 大阪大学, 健康体育部, 教授 (00028656)
三輪 岳志 大阪大学, 遺伝情報実験施設, 助教授 (20174229)
今井 圓裕 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (00223305)
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| キーワード | myofibroblast / 平滑筋アルファアクチン / CEBPα / CArG element |
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| 研究概要 |
平成14年度
我々はすでに、yeast one hybrid systemを利用したDNA結合蛋白質のcDNAクローニングで平滑筋細胞およびmyofibroblastでのSMαA発現誘導に関わる転写因子の候補を複数個同定しているが、CCAAT enhancer binding protein(CEBP)ファミリーに属する転写因子CEBPdeltaについて、その機能的側面の解析とmyofibroblast形成、さらには進行性腎障害の線維化病変形成過程でのこれら転写因子の果たす役割をin vitro、in vivoの両方の実験系で検証することを本年度の計画とした。
1)SMαA遺伝子転写誘導能の検証-in vitroの解析:
我々がクローニングによって同定したCEBPdeltaの発現ベクターを構築し、in vitroでこれら転写因子の強制発現系を作成しSMαA由来CArG配列にレポーター遺伝子を結合したベクターとのco-transfectionによるreporter assayを実施したところ、4倍程度の転写活性増強が確認された。
2)CArG elementへの結合蛋白質によるSMA発現誘導-in vivoの解析:
・CArG領域周辺に1塩基変異を導入することによってSRFを結合しない配列(4MCASrG)とOct-1を結合しない配列(-1MCArG)の作成に成功しており、これらの下流にレポーター遺伝子であるCATを結合したコンストラクトを発現するトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスの正常状態でのCATの発現を全身臓器で解析するとともに、糸球体病変と尿細管間質病変を惹起したモデルマウスでメサンギウム細胞、尿細管間質細胞のmyofibroblastへの形質変換過程でのCAT発現を解析したところ、-1MC ArGではCAT活性が完全に消失したが、4MCArGにおいては野生型のプロモータによるCAT活性に比べて1/5程度には減少するが臓器別の発現パターンは野生型と同様であり、また、糸球体メサンギウムおよび間質線維芽細胞でのCAT活性も低下はするが有意であった。この成績は、Oct-1の結合がSMαAに必須でありSRFはそれを増強する働きをすることを示している。
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