尿細管上皮特異的発現カセットとiKB遺伝子を用いた抗腎間質病変抑制遺伝子の作成

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14571033
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 菅野 義彦 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (30276232)
• 研究分担者: 岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (60233342)
• キーワード: オステオポンチン(OPN) / 尿細管上皮 / transfection / iKB / promoter

研究概要

本研究ではマウス近位尿細管上皮細胞(mPTEC)(田辺製薬:菅谷 健氏より供与)を用いて、上流域より様々なdeletionを加えたオステオポンチン(OPN)5'geneにluciferase cDNAを連結したreporter gene constructを作成し、lipofectin法を用いたtransient transfectionによりその転写活性の測定を行った。Transfectionにあたってはpromega社のTransFast Transfection Reagentを用いた。使用しているmPTECではcDNA:TransFast 5μg:20μlの比率で最も導入効率がよかった。測定にはpromega社のDual-Luciferase Reporter Assay Systemを用いた。また、OPN発現を認める、繊維芽細胞(3T3)、リンパ球/単球(RAW264)を用いて、同様のtransfectionを行うことで、そのpromoter活性の尿細管上皮細胞特異性についての検討を行った。以上の検討により、OPN遺伝子においてmPTECでは-825〜-606および-189〜-115の領域に、また3T3、RAW264では-189〜-115の領域に転写促進部位が認められたことより、現在まで-825〜-606の領域が尿細管上皮特異的領域と示唆されている。今後更に領域を狭め、minimal OPN promoterを決定し、NfKBの機能を抑制するiKB分子を過剰発現させる遺伝子minimal OPN promoter+iKB cDNA fusion geneを作成しトランスジェニックマウスを用い、in vivoでの検討も行う予定である。