| 研究課題/領域番号 |
14571067
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
野村 政壽 九州大学, 大学病院, 助手 (30315080)
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| 研究分担者 |
柳瀬 敏彦 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (30239818)
後藤 公宣 九州大学, 大学病院, 助手 (90284512)
岡部 泰二郎 九州大学, 大学病院, 助手 (40264030)
名和田 新 九州大学, 大学院・医学研究院, 教授 (10038820)
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| キーワード | 膵β細胞 / Cre-loxP / ノックアウトマウス / アクチビン / Smad / アクチビン受容体 / インスリン |
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| 研究概要 |
Smad2コンディシヨナルノックアウトマウスの開発:loxP配列を有するターゲティングベクターを作成、胚性幹細胞(ES細胞)に導入し、相同変異体を得た。CRE発現ベクターの一過性導入により変異ES細胞よりネオマイシン耐性遺伝子カセットを除去した後、C57/BL6J由来の胚盤胞にインジェクションし、Smad2loxpキメラマウスの作成、C57/BL6Jと交配し、Germline transmissionを確認、目的のSmad2loxマウスの作製に成功した。Smad2loxマウスとCre recombinaseを膵β細胞特異的に発現するトランスジェニックマウス(Ins-Cre)を交配し、膵b細胞特異的Smad2ノックアウトマウス(βSmad2KO)を作成した。βSmad2KOマウス膵β細胞でのSmad2発現の消失は免疫組織染色により蛋白レベルで確認した。
Smad2loxマウスラ氏島ではSmad2抗体によりβ細胞が主に染色されたが、一方βSmad2KOマウスでは全く染色されなかった。さらにRNAレベルでの発現を確認するため、ラ氏島をそれぞれのマウスより単離してRNAを抽出、Real-time RT-PCR法によりSmad2遺伝子発現を確認したところ、βSmad2KOではSmad2loxと比較し約10%以下にその発現が低下していた。ラ氏島の約90%をβ細胞が占めることより、今回我々が作成したβSmad2KOマウスではほぼ完全に膵β細胞でSmad2がノックアウトされていると考えられる。βSmad2KOマウスは正常に出生し、6ヵ月までの観察では正常に生存している。しかしながら、糖負荷試験において著明な耐糖能異常を示すことが明かとなった。現在その分子機構を解析中である。
ActRIBトランスジェニックマウスの開発:[CAGプロモーター/loxP/EGFP/loxP/ActRIB cDNA/Iresbgeo]通常は目的とするcDNAの発現はなく、CREの発現により、loxPで挟まれたGFPカセットが除去され初めてcDNA発現をみとめるコンストラクトを構築。受精卵へマイクロインジェクション、トランスジェニックマウスの作成を完了した。トランスジェニックマウスでのGFP発現を無事確認した。βSmad2KOマウスと同様にIns-Creマウスと交配し、膵β細胞特異的アクチビン受容体発現マウスを作製した。現在解析中である。
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