興奮性神経細胞死における神経細胞核DNA損傷・修復の1分子イメージングによる評価

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14571306
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 山本 清二 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教授 (60144094)
• 研究分担者: 櫻井 孝司 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362) ; 寺川 進 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246)
• キーワード: 興奮性神経細胞死 / イノシトール三リン酸 / DNA断片化 / 1分子イメージング / 全反射型蛍光顕微鏡 / ミトコンドリア障害

研究概要

A.目的
神経細胞核DNAがグルタミン酸によりどのような損傷を受けるのかを明らかにする。
B.結果および成果
ラット培養海馬神経細胞を用い、グルタミン酸の一過性(20分間)投与により神経細胞およびその核DNAはどのような損傷を受けるのかを検討した。形態変化はビデオ強化型微分干渉顕微鏡で観察し、蛍光色素によりカスパーゼ3の活性化を、核DNAが断片化を全反射型蛍光顕微鏡を用いたDNA1分子のイメージングにより解析した。
その結果、グルタミン酸は容量依存的に、また一過性投与後の時間経過に依存して、カスパーゼ3を活性化した。staurosporine投与後にも神経細胞にてアポトーシスが起こりカスパーゼ3が活性化されている事が確認できた。まだグルタミン酸20分投与後の遅発性細胞死の形態をAnexin-V-FITCとPropidium Iodideにより検討するとアポトーシスであることが判った。アポトーシスを来たした神経細胞を顕微鏡下に採取し1分子のイメージングにより解析すると、グルタミン酸連続投与による急性神経細胞死とは異なっていたが、核DNAの変化の差異を定量的に評価する方法を確立するまでには至らず、今後その方法を確立する課題が残された。
他にグルタミン酸による興奮性神経細胞死のメカニズムの一端として、ミトコンドリア毒(FCCP)による神経細胞死を検討した。この場合でも前年度明らかにしたグルタミン酸による場合と同様にIP_3システムをdeath signalとして、核内カルシウムイオン濃度が上昇し核DNAの断片化が起こることが明らかとなり、興奮性神経細胞死の過程で起こるミトコンドリア機能障害はIP_3システムを介して核DNAに関与していることを示した。さらに、ミトコンドリア障害によるエネルギー不全の結果もたらされる細胞内アシードーシスに関連して、Na^+/H^+ exchanger阻害剤の効果を検討し細胞内へのカルシウムイオンの過負荷を抑制することにより神経細胞死を抑制していることを見出した。

研究成果

• [文献書誌] Hisae Nakahara, et al.: "Morphological changes induced by apoptosis inducer, ataurosporine, in rat hippocampal neurons"Neurotrauma Res. 14. 24-26 (2002)
• [文献書誌] Seiji Yamamoto, et al.: "Excitotoxic signal rapidly induces random nuclear DNA fragmentation through inositol trisphophate pathway"J Cereb Blood Flow Metab. 23(Suppl 1). 338 (2003)
• [文献書誌] Seiji Yamamoto, et al.: "An Na+/H+ exchanger inhibitor suppresses cellular swelling and Neuronal death induced by glutamate in cultured cortical neurons"Acta Neurochir. Suppl 86. 223-226 (2003)
• [文献書誌] Seiji Yamamoto, et al.: "Single molecule analysis of glutamate-induced random DNA fragmentation in acute excitotoxicity"Jpn J Physiol. 53(Suppl 1). S323 (2003)
• [文献書誌] Fan WenYing, et al.: "Caspase 3 activation induced by glutamate in cultured hippocampal neurons"Neurotrauma Res. 15(in press). (2003)