| 研究課題/領域番号 |
14571306
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
脳神経外科学
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
山本 清二 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教授 (60144094)
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| 研究分担者 |
寺川 進 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246)
櫻井 孝司 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2003
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| キーワード | 興奮性神経細胞死 / イノシトール三燐酸 / DNA断片化 / 1分子イメージング / 全反射型蛍光顕微鏡 / single molecule imagine |
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| 研究概要 |
A.目的
神経細胞核DNAがグルタミン酸によりどのような損傷・修復を受けるのかをDNA1分子のイメージングにより明らかにする。
B.結果および成果
ラット培養海馬神経細胞を用い、形態変化はビデオ強化型微分干渉顕微鏡で観察し、カルシウムイオン動態、セカンドメッセンジャーシステムの動態を検討した。その結果、グルタミン酸(1mM)とNMDA(1mM)はそれぞれ投与後20分以内にイノシトール三リン酸(IP_3)の上昇、核内カルシウムイオン濃度の持続的上昇、核内顆粒の出現を引き起こした。健常な神経細胞を顕微鏡下に採取し、DNAを抽出後、核酸を蛍光色素(YOYO-1)で染色し、対物レンズ型全反射照明蛍光顕微鏡で観察すると、DNAは1本の線状に観察されるが、核内顆粒を伴う神経細胞の核DNAは粒子や小さい断片のブラウン運動として観察され、正電荷コートしたガラス上では様々な長さと形態の断片として観察された。また、グルタミン酸による神経細胞死の過程で、蛍光色素によりカスパーゼ3の活性化を解析した。その結果、グルタミン酸は容量依存的に、また一過性投与後の時間経過に依存して、カスパーゼ3を活性化した。staurosporine投与後にも神経細胞にてアポトーシスが起こりカスパーゼ3が活性化されている事が確認できた。アポトーシスを来たした神経細胞を顕微鏡下に採取し1分子のイメージングにより解析すると、グルタミン酸連続投与による急性神経細胞死とは異なっていたが、核DNAの変化の差異を定量的に評価する方法を確立するまでには至らず、今後その方法を確立する課題が残された。
C.まとめ
急性興奮性神経細胞死の過程では、IP_3システムをdeath signalとして、核内カルシウムイオン濃度が上昇し、核DNAの断片化が起こることが明らかとなった。また、グルタミン酸による一過性の刺激では、遅発性にアポトーシスを来し急性変化とは異なるDNA断片化を来たしていた。
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