虚血性神経細胞死におけるユビキチン化蛋白質蓄積の意義に関する研究

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14571336
• 研究機関: 東京慈恵会医科大学
• 研究代表者: 高田 耕司 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教授 (30179452)
• 研究分担者: 塩田 清二 昭和大学, 医学部, 教授 (80102375)
• キーワード: ユビキチン / 脳虚血 / ユビキチン化タンパク質 / アフィニティー精製 / 免疫沈降 / タンパク分解 / ユビキチン結合酵素 / UbE2D2

研究概要

脳虚血による神経細胞の傷害機構を解明するため、虚血ストレスで増える脳内ユビキチン(Ub)化タンパク質を解析した。材料には、一過性中大脳動脈閉塞マウスの大脳皮質を用い、その水溶性画分と8M尿素可溶化(尿素溶性)画分を分析に供し、以下の知見を得た。
1.再灌流0〜10時間後、虚血側で尿素溶性ポリUb化タンパク質が増加した。
2.尿素溶性ポリUb化タンパク質の精製法を確立した。すなわち、尿素溶性画分を4M尿素に透析後、タンパク質100〜250mgを抗Ub-FK2抗体カラムに展開し、吸着成分を3.5M MgCl2で溶出した。結果、タンパク質は0.1〜0.4mgに減じたが、結合型Ubは100%回収され、高い精製効率を示した。次にゲル濾過で高分子量領域の同タンパク質を得た。
3.Ub化基質タンパクを同定する方法を開発した。すなわち精製物をendoproteinase Asp-Nで消化し、UbのC末端断片D58-G76(UCP)を認識する抗体で免疫沈降後、逆相HPLCで展開した。分離された複数ペプチドの1次構造を解析した結果、K48型Ub鎖やUb化タンパク質に由来するUCP-ペプチド断片が同定された。その中から、虚血脳に特有の成分としてcyclin-dependent kinase 5(Cdk5)が見出された。
4.Cdk5抗体によるWestern blotや免疫組織化学を用い、虚血ストレスが超高分子量Ub化Cdk5を出現させることやCdk5自身の細胞内局在を変えることを見出した。
5.虚血脳に特徴的な水溶性タンパク質として、Ub化反応中間体であるUb活性化酵素UbE2D2-Ubチオエステルを精製・同定した。
以上、脳虚血はCdk5のK48鎖型Ub化を誘導し、同反応へのUbE2D2の関与が示唆された。Cdk5は脳神経系の形成と機能に関る重要な分子であり、上記のUb化は脳虚血性神経傷害の新たな機構と考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Ohtaki, H., Funahashi, H., Mizushima, H., Ogawa, A., Maeda, M., Oguro, T., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Goto, N., Shioda, S.: "Reduction of focal ischemic brain injury via the suppression of peroxynitrite formation in mice deficient in ineterlerukin-1."Neurosci.Res.. 45. 313-324 (2003)
• [文献書誌] Okawa, Y., Takada, K., Minami, J., Aoki, K., Shibayama, H., Ohkawa, K.: "Purification of N-Terminally Truncated Histone H2A-Monoubiquitin Conjugates from Leukemic Cell Nuclei : Probable Proteolytic Products of Ubiquitinated H2A."Int.J.Biochem.Cell Biol.. 35. 1588-1600 (2003)
• [文献書誌] Osaka, H., Wang, Y.L., Takada, K., Takizawa, S., Setsuie, R., Li, H., Sato, Y., Nishikawa, K., Sun, Y.J., Sakurai, M., Harada, T., Hara, Y., Kimura, I., Chiba, S., Namikawa, K., Kiyama, H., Noda, M., Aoki, S., Wada, K.K.: "Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron."Hum.Mol.Genet.. 12. 1945-1958 (2003)
• [文献書誌] Ohtaki, H., Endo, S., Nakamachi, T., Yin, L., Dohi, K., Kudo, Y., Iwai, Y., Matsunaga, M., Goto, N., Shioda, S.: "Increased expression of intercellular adhesion molecute-1 (ICAM-1) in mouse brain following transient cerebral ischemia."Acta Histochem. Cytochem.. 36. 385-391 (2003)
• [文献書誌] Ohtaki, H., Takaki, A., Yin, L., Dohi, K., Nakamachi, T., Matsunaga, M., Horai, R., Asano, M., Iwakura, Y., Shioda, S.: "Suppression of oxidative stress after transient focal ischemia in interleukin-1 knock out mice."Acta Neurochir.. 86(Suppl). 191-194 (2003)
• [文献書誌] Ishibashi, Y., Hanyu, N., Suzuki, Y., Yanai, S., Tashiro, K., Usuba, T., Iwabuchi, S., Takahashi, T., Takada, K., Ohkawa, K., Urashima, M., Yanaga, K.: "Quantitative Analysis of FreeUbiquitin and Multi-ubiquitin Chain in Colorectal Cancer."Cancer Lett.. (印刷中). (2004)