| 研究概要 |
2年度は、初年度の結果を踏まえ、放射線増感作用がE_4より強いと報告されるE_<9ns-2>(SD Scott et al.2002)を用いて初年度と同様の検討を行った。すなわち、5'-GATCT(CCATATAAGG)_9GCGAT3'と5'-CGC(CCTTATATGG)_9A-3'のolgodeoxyribonucleotide pairからE_<9ns-2>を構築し、pCIneo-plasmid vector (Promega)を母体として昨年と同様の手順で各種plasmid (pCI-neo/E_<9ns-2>/EGFP,pCI-neo/E_<9ns-2>/HSV-tk)を作成した。ついでU251-MG/U373-MG human glioma cell lineおよびC6 rat glioma cell lineにE_<9ns-2>/EGFPを導入し、3Gyを照射して蛍光顕微鏡下観察およびWestern blottingで評価したが、予想に反してEGFP発現は照射前後で有意な変化を示さなかった。5、7、10Gyで同様の検討を行うもやはり有意差は生じなかった。HSV-tk導入後放射線照射によるMTT assay評価法は、初年度E_4発現がtrypsin処理等で活性化されてしまった可能性を考慮して、trypsin処理等物理化学的刺激を与えてから初年度の結果より活性化が消失すると判明している72時間後に放射線照射/GCV投与を施行した。結果、U251-MG,U373-MG,C6いずれにおいても、E_<9ns-2>/HSV-tk導入群において有意な増殖抑制は認められず、既報と違いE_<9ns-2>の放射線増感作用は否定された。今後はE_4を用いHSV-tk導入72時間後放射線照射によるMTT assayを再評価し、C6および血管内皮前駆細胞へのE_4/HSV-tk導入後当初計画したin vivo実験へと進む予定である。
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