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本研究は、遺伝子増幅とマイクロアレイ、マクロアレイ技術を用いて、少量の細胞集団の遺伝子発現をプロファイリングすることにより、多彩な細胞が存在するといわれる歯根膜の細胞の性質を明らかにしようとするものである。本年度は研究計画に記載した研究を実施すべく、方法論の検討を中心に行った。細胞集団を得る方法として、歯根膜を酵素処理し分解した後、培養し通法に従いクローニングする手法を想定したが、回収可能な歯根膜の量、細胞含有量が少ないことより、生育する細胞数が限られており、分離の手法により細胞群の選択が起こっていることが示唆された。そこで、いったんoutgrowth法で生育した細胞を、培養ディッシュ上でmicrodisection法を利用して単離する手法を考案した。この手法により、細胞に障害の少ない状態で生育させた状態で任意の細胞を単離し、単一細胞由来の細胞集団を得ることが可能となった。また、微量な細胞からRNAを回収し、逆転写反応、さらに定量PCRを行う一連の手法を構築した。この手法により、細胞のみならず、実験動物の抜去歯に付着した歯根膜そのものからRNAを抽出し、定量PCRを実行し遺伝子発現の増減を定量化した。実験動物の歯根膜でin vivoで遺伝子発現をin situ hybridization法で解析したHGF遺伝子を、この方法で定量化した。
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