| 研究課題/領域番号 |
14572032
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
植田 正 九州大学, 大学院・薬学研究院, 教授 (90184928)
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| 研究分担者 |
阿部 義人 九州大学, 大学院・薬学研究院, 助教授 (60315091)
井本 泰治 崇城大学, 工学部, 教授 (90038282)
出原 賢治 佐賀大学, 医学部, 教授 (00270463)
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| キーワード | 核磁気共鳴法 / インターロイキン13 / 緩和解析 / アレルギー / チオレドキシン / 安定同位体ラベル |
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| 研究概要 |
昨年度は、His Tag-エンテロキナーゼ切断配列(V-D-D-D-D-K)-IL-13の順で遺伝子を構築し、大腸菌を用いてこの融合蛋白質を大量に発現できたことを報告した。本年度は、まずその融合蛋白質からIL-13を得るために、融合蛋白質をエンテロキナーゼで消化した。しかし、融合蛋白質の溶解度が悪く、目的のIL-13をほとんど得ることができなかった。そこで、チオレドキシンとの融合蛋白質でIL-13を産生する発現系を構築した。その際にPreScission proteaseの切断サイトであるL-E-V-L-F-Q-G-PをチオレドキシンとIL-13との間に挿入した。PreScission proteaseはこの配列のFQとGPとの間を切断する酵素であるが、IL-13のN末端の2残基が、たまたまGP配列であるので都合がよい。この融合蛋白質の発現系を構築し、目的の蛋白質を産生したところ、1Lの培養液あたり30mg程度の変性融合蛋白質が得られた。この融合蛋白質を変性剤に溶解し、徐々に変性剤を除いて、融合蛋白質を再生させた後、pH8でこのプロテアーゼを作用させることにより、融合蛋白質よりIL-13を切断することができた。さらに、ゲルクロマトグラフィーを行いIL-13を精製した。同様な方法で、^<15>N均一ラベル化した融合蛋白質から、^<15>N均一ラベル化したIL-13を精製した。また、既報の手法に従いIL-13再生体を得た。同様な方法で、アレルギー患者に見いだされたIL-13の変異体(R112Q)の^<15>N均一ラベル体の調整も行った。野生型及び変異型IL-13についてNMRを用いて緩和解析を行った。
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