光学活性な二核鉄錯体による部位特異的な二本鎖DNA切断と人工制限酵素への応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14572034
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 黒崎 博雅 熊本大学, 薬学部, 助手 (70234599)
• 研究分担者: 後藤 正文 熊本大学, 薬学部, 教授 (50080180)
• キーワード: 鉄錯体 / DAN切断 / 過酸化水素 / 酸化反応 / ESR / 光学活性 / CDスペクトル / 電子スペクトル

研究概要

本研究は標的生体高分子に二本鎖DNAを選び、光学活性なジアミンから誘導される二核鉄錯体による二本鎖DNAの目的位置を選択的に切断する人工制限酵素の開発を行い染色体DNAの機能制御を目指す.
1,8-anthracenedialdhydeとN',N'-dipyridylmethyl-R,R-cyclohexane-1,2-diamineとから誘導される光学活性な複核配位子1,8-(N-anthranylmethyl)-bis(N',N'-dipyridylmethyl-R,R-cyclohexane-1,2-diamine)(1)を合成した.
次に1のプラスミドpUC19DNAの切断能について検討した.条件:空気下,鉄(III)塩をモル比1:2でよく混ぜたもの又は鉄(III)塩のみをそれぞれDNAの50.0mM Tris Borate buffer (pH 8.1)溶液に添加し,すぐにH_2O_2(酸化剤)を加え,37℃で60minインキュベートした.その後,反応停止剤として0.5M EDTA bufferを加え,エチジウムブロマイド含有1.0%アガロースゲルを用いて電気泳動を行った.蛍光強度から,Form I, Form II,およびForm IIIの生成比を求めた.
0.53μgのDNAに対して,1の濃度を1〜10μMまで変化させたところ,1の濃度が8μMとき、FormIは完全に消失しForm II(84%)とForm III(6%)が生成することがわかった.7μM以下の濃度ではForm I(13%),Form II(84%)とForm III(3%)の割合で切断した.コントロール実験としてFe(III)イオンで行なったところ,Form IIIは生成しなかった.
これらの結果から,1はプラスミドpUC19DNAを酸化的に切断することがわかった.

研究成果

• [文献書誌] Masafumi Goto: "DNA Cleavage by Pentadentate Iron(II) Complexes Containing Fluoro-Substituted Phenyl Groups"Bioorg. Med. Chem. Lett.. 12. 201-203 (2002)
• [文献書誌] Masafumi Goto: "Detection of a metallo-β-lactamase (IMP-1) by fluorescent probes having dansyll and thiol groups"Org. Biomol. Chem.. 1. 17-20 (2003)
• [文献書誌] Masafumi Goto: "Crystal Structure of 7,8-Dihydroxy-4-methylcoumarin"Anal. Sci.. (in press). (2003)
• [文献書誌] Masafumi Goto: "Interaction of Binuclear Xylylthiolato(2,2',2"-terpyridine)platinum(II) Complexes with DNA"Bioorg. Med. Chem. Lett.. 13. 825-828 (2003)