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本研究では、カンナビノイド受容体の内因性リガンドであるアナンダミド(AN)および2-アラキドニルグリセロール(2-AG)を、マイクロダイアリシス(MD)により定量できる分析法の開発、ならびに本法を用いて薬物刺激時における組織中ANおよび2-AG濃度の変動を調べることを目的としている。現在までにMDにより、生体内ANおよび2-AG濃度の変動を調べた報告は少ない。これは、ANおよび2-AGともに低濃度で存在することに加えて、これらの内因性リガンドがMD膜へ非特異的に吸着するために回収率が低下し、両リガンドの検出がより困難になるためである。本年度は、MDにおけるANの回収率向上および蛍光誘導体化の最適化を行うために、以下の実験1、2を行った。
1.MDの透析液中に水溶性であるTrimethyl-β-cyclodextrin(TM-β-CD)を添加剤として加えることで、プロスタグランジン類の回収率の向上が報告されていたことから、0-5.0%TM-β-CDを含む透析液を用いて、ANの回収率をin vitroにて検討した結果、0.1%TM-β-CD含有時が最も高回収率であった。また、透析液の流速は6μL/minで行った場合に最大の回収量が得られた。
2.本研究では、ANを蛍光誘導体化後、HPLCにより分離定量を行う方法を採用している。そのため、ANの蛍光誘導体化の反応率を最大にすることが必要である。そこで、トリチウム標識ANを用いて、蛍光誘導体化の反応率について調べた結果、60℃、2時間の条件下では、ANの放射能ピークが完全に消失し、AN蛍光誘導体の放射性ピークが出現した。このことから、60℃、2時間の反応で、蛍光誘導体化反応が定量的に進行していることが確認された。
今後は、更なるANの回収率の向上を目指し、他の添加剤を検討する予定である。
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