| 研究課題/領域番号 |
14572180
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村手 隆 名古屋大学, 医学部, 教授 (30239537)
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| 研究分担者 |
小泉 恵子 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (00118027)
高木 明 名古屋大学, 医学部, 助手 (30135371)
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助教授 (50116852)
鈴木 元 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (80236017)
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| キーワード | スフィンゴシンキナーゼ / ポリクローナル抗体 / 転写調節 / プロモーター解析 |
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| 研究概要 |
ヒト スフィンゴシンキナーゼ1(h-SPHK1)抗体の作成:本年度にh-SPHK1とmaltose brinding protein(MBP)遺伝子との融合タンパクを大腸菌にて産生し、resin columnにて精製した。これをウサギに免疫して得られた抗血清を硫安分画後にproteoin G columnにてIgGに精製した。SDS PAGE gelにてWesteren blottingを行い、得られた抗体の性格付けを行った。結果、抗血清は250倍希釈でも十分に抗MBP活性および抗h-SPHK1抗体括性を有していたが,細胞融解液を用いた解析では目的の分子量以外の所にもバンドを認めたため、現在は抗体の吸収を各種試みている。一方、oligo-peptideによるウサギの免疫を行い,あらたにポリクローナル抗体の作成と抗原oligo-peptideを用いたaffinity columnによる精製で、より特異性の高い抗体の作成を再度試みている。
ヒト スフィンゴシンキナーゼ1転写調節機序の解明:本年度にヒト巨核芽球性白血病細胞株MEG-O1をPMAで処理し巨核球系に分化誘導した時、スフィンゴシンキナーゼ活性、h-SPHK1タンパク、h-sPHK1の転写レベルが増加することを明らかにした。さらに5'RACE法を用いてh-SPHK1遺伝子の転写開始部位を決定した。それにもとづいて第一エクソン上流および第一イントロン部位に存在すると考えられるプロモータ領域について欠失および変異体を作成して、それらをプロモーター解析に汎用されるluciferase vectorに導入して各々の部位のプロモーター活性を測定した。さらに最もプロモーター活性に関与すると思われた2箇所の転写因子結合部位に関してMEG-O1細胞核タンパクを用いてelectrophoresis mobility shift assayを行い、PMAによるパンドのパターンの変化を解析した。
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