研究分担者 |
小泉 恵子 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (00118027)
高木 明 名古屋大学, 医学部, 助手 (30135371)
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
坂野 喜子 岐阜大学, 医学部, 助教授 (50116852)
鈴木 元 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (80236017)
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研究概要 |
ヒト巨核芽球性白血病細胞株MEG-O1のPMA刺激時のスフィンゴシンキナーゼ1のメッセージレベル,酵素活性,タンパクレベルを解析し,スフィンゴシンキナーゼ1遺伝子5'側のプロモーター領域の解析でPMA反応に必須領域の同定ならびに結合転写因子の解明を試みた.我々の実験から(1)PMAはSPHK1遺伝子の転写を誘導する(2)MEG-O1細胞にhSPHK1遺伝子の転写開始点は少なくとも2つ存在する(3)PMAで刺激される転写で、プロモーター活性はファーストエクソンの5'プロモーター領域とファーストイントロンに各々存在する事が明かとなった.TFSEARCH programをもちいたコンピューター解析で4つ(AP4,two AP-2,Sp1)のPMA関連転写因子結合部位を想定し,この予想転写因子結合部位を正確に取り除く、あるいは予想転写因子結合部位にミューテーション入れた様々なレポーターコンストラクトを作成した。結果,PMA反応性は、遺伝子5'側のSp1と2つのAP-2結合サイトで十分である事が示された。プロモーター解析の結果に基づき作成した2つのプローブ,oligo-1(containing distal AP-2 site)とoligo-2(containing both Sp1 and proximal AP-2 site)を用いたEMSAの解析においても,oligo-2に含まれるSp1結合部位とoligo-1とoligo-2ともに含まれるAP-2結合部位はSPHK1遺伝子発現をPMA反応性に決定するPMA誘導性転写因子結合部位であることが示された。
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