修飾蛋白質(亜硫酸化、ニトロソ化他)の精密構造と生成過程の解明、臨床検査への応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14572189
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 清水 章 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00028581)
• 研究分担者: 宮崎 彩子 大阪医科大学, 医学部, 助手 (20298772) ; 岸川 匡彦 大阪医科大学, 医学部, 助手 (40268199) ; 中西 豊文 大阪医科大学, 医学部, 講師 (10247843)
• キーワード: 蛋白質修飾構造 / 亜硫酸化 / トランスサイレチン / 質量分析 / エレクトロスプレイ / 免疫沈降法 / ホモシステイン / モリブデン補因子欠損症

研究概要

私たちはこれまで、ヘモグロビン、トランスサイレチン、スーパーオキシドジスムターゼのアミノ酸変異を質量分析によって同定し、臨床に寄与してきた。血清中蛋白質の短時間で確実な試料調整法として、免疫沈降法が有用であることを示し、プロテインGAセファローズを用いるなど改良を加え、修飾構造蛋白質の比率を高い精度で測定できることを示した。
モリブデン補因子欠損症において亜硫酸結合トランスサイレチンが著しく増加していることを見出した。試料が、空気に触れると、亜硫酸結合のピークが高くなる。正常のヒトでも少しは亜硫酸結合のトランスサイレチンが上昇するが、血中のシステインと反応してシステイントランスサイレチンが上昇し、この方が高いので、区別できることを見出した。正常では、代謝過程で生じる亜硫酸や、外から入った亜硫酸が結合するのではなく、混合ジスルフィド結合を形成したチオール化合物が分解して亜硫酸化トランスサイレチンが生じる事を示すデータが得られつつある。ほかにホモシステインの増える疾患、4ヒドロ葉酸還元酵素欠損症で、ホモシステイン結合TTRが増高することを見出した。亜硫酸化トランスサイレチンはアミロイド形成に関連する可能性があり、ホモステインは酵素の作用によりホモシステインチオラクトンとなり、蛋白質に結合し、この反応が動脈硬化病変形成に関係している。
臨床検査医学の領域で蛋白質の修飾構造が最も注目されているのはヘモグロビンおよび血清蛋白へのグルコーネの結合である。本研究では、HbA1cの質量分析による精密、正確測定を行った。重水素で7ヶ所標識したロイシンを組みこんだ、糖化および非糖化のβ鎖N末端ヘキサペプチドを合成し、これを内部標準物質に用いた。これにより、変動係数2%以下の高精密度の分析法を確立した。これは標準法として今後有用である。

研究成果

• [文献書誌] Masahiko Kishikawa, Jorn Oliver Sass, Nobuo Sakura, Toyofumi Nakanishi, Akira Shimizu, Masanori Yoshioka: "The Peak Height Ratio of S-Sulfonated Transthyretin and Other Oxidized Isoforms as a Marker for Molybdenum Cofactor Deficiency, Measured by Electrospray Ionization Mass Spectrometry"Biochimica et Biophysica Acta. 1588. 135-138 (2002)
• [文献書誌] Toyofumi Nakanishi, Ayako Miyazaki, Akira Shimizu, Akifumi Yamaguchi, Satoshi Nishimura: "Assessment of the Effect of Hemoglobin Variants on Routine HbA1c Measurements by Electrospray Ionization Mass Spectrometry"Clinica Chimica Acta. 323. 89-101 (2002)
• [文献書誌] Akira Shimizu, Toyofumi Nakanishi, Masahiko Kishikawa, Ayako Miyazaki: "Detection and Identification of Protein Variants and Adducts in Blood and Tissues : an Application of Soft Ionization Mass Spectrometry to Clinical Diagnosis"Journal of Chromatography B. 776. 15-30 (2002)
• [文献書誌] Toyofumi Nakanishi, Ken Iguchi, Akira Shimizu: "Measurement of HbA1c based on peptide analysis by ESI-mass spectrometry using deuterium-labeled synthetic peptides as internal standards"Clinical Chemistry. (in press).
• [文献書誌] A.Miyazaki, T.Nakanishi, A.Shimizu, H.Hisamitsu: "The first case of a single heterozygote of an abnormal hemoglobin, Hb Stanmore, [b111(G13)Val→Ala]"Journal of Chromatography B. (in press).
• [文献書誌] Reiko Koyama, Toyofumi Nakanishi, Tsunehiko Ikeda, Akira Shimizu: "Catalogue of soluble proteins in human vitreous humor by one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and electrospray ionization mass apectrometry including seven angiogenesis-regulating factors"Journal of Chromatography B. (in press).