修飾蛋白質(亜硫酸化、ニトロソ化他)の精密構造と生成過程の解明、臨床検査への応用

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14572189
• 研究機関: 大阪医科大学
• 研究代表者: 清水 章 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00028581)
• 研究分担者: 宮崎 彩子 大阪医科大学, 医学部, 助手 (20298772) ; 中西 豊文 大阪医科大学, 医学部, 講師 (10247843)
• キーワード: 蛋白質修飾構造 / 亜硫酸化 / トランスサイレチン / 質量分析 / エレクトロスプレイ / 免疫沈降法 / ホモシステイン / モリブデン補因子欠損症

研究概要

蛋白質の修飾構造を質量分析によって調べ、病態の解明、病気診断に応用することを目的に研究を進めた。
1)蛋白質の修飾構造のうち、ヘモグロビン分析の過程で質量数29Da大きい成分が全ヘモグロビンの3〜4%存在するケースが全分析例、約4,500例のうちの0.2%に認められた。この成分を分離し、トリプシン分解によりペプチドとして分析したところ、N末端にアルデヒドが結合したものであることが分かった。飲酒による影響と考えられた。
2)トランスサイレチン(TTR)を材料とし、質量数80Da非修飾(Native)TTRより大きい成分(+80TTR)を見出し、先天性に亜硫酸を硫酸に酸化できない疾患、サルファイトオキシダーゼ欠損症およびモリブデン補因子欠損症では+80TTRが大部分を占めることを見出した。ペプチドの分析により、TTR10番目のシステインに亜硫酸が結合していることを明らかにした。
3)一方、トランスサイレチンを室温で空気に数日さらすことにより、+80TTRが増量することを見出した。トランスサイレチンのシステインを含む周辺の配列をもつペプチドを合成し、検討したところ、亜硫酸はシステインがジスルフィド結合を形成したのちに、β脱離反応を起こし、亜硫酸化システインを生じることを明らかにした。同時に、システインがデヒドロアラニンに変化し、さらにグリシンに変化したペプチドを証明した。デヒドロアラニンはシステインやリジン、ヒスチジンの側鎖と反応しやすい性質を持っており、これがアミロイド形成の反応機構の可能性があり、今後の研究対象とする。
4)メチレンテトラヒドロ葉酸欠損症などのホモシスチン尿症では血中にホモシスチン、あるいはホモシステインが増加することが知られている。我々は、これら疾患患者血清中のTTRを分析し、ホモシステイン結合TTRが形成されていることを見出した。この成分は正常では検出されず、診断および治療効果の判定に役立つ。

研究成果

• [文献書誌] Akira Shimizu, Toyofumi Nakanishi, Masahiko Kishikawa, Ayako Miyazaki: "Detection and Identification of Protein Variants and Adducts in Blood and Tissues : an Application of Soft Ionization Mass Spectrometry to Clinical Diagnosis"Journal of Chromatography B. 776. 15-30 (2002)
• [文献書誌] Toyofumi Nakanishi, Ken Iguchi, Akira Shimizu: "Method for Hemoglobin Alc Measurement of HbAlc based on peptide analysis by ESI-mass spectrometry using deuterium-labeled synthetic peptides as internal standards"Clinical Chemistry. 49. 829-831 (2003)
• [文献書誌] Reiko Koyama, Toyofumi Nakanishi, Tsunehiko Ikeda, Akira Shimizu: "Catalogue of soluble proteins in human vitreous humor by one-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry including seven angiogenesis-regulating factors"Journal of Chromatography B. 792. 5-21 (2003)
• [文献書誌] Ayako Miyazaki, Toyofumi Nakanishi, Akira Shimizu, Kenichi Ninomiya, Satoshi Nishimura, Kiyohiro Imai: "HB BUZEN [β138(H16)Ala→Thr]. A new β variant"Hemoglobin. 27. 243-247 (2003)
• [文献書誌] Jorn.Oliver, Sass, Toyofumi NaKanishi, Takako Sato, Wolfgang Sperl, Akira Shimizu: "S-Homocysteinylation of transthyretin is detected in plasma and serum of humans with different types of hyperhomocysteinemia"Biochemical and Biophysical Research Communications. 310. 242-246 (2003)
• [文献書誌] Toyofumi Nakanishi, Takako Sato, Saburo Sakoda, Masanori Yoshioka, Akira Shimizu: "Modification of cysteine residue in transthyretin and a synthetic peptide, analyses by electrospray ionization mass spectrometry"Biochimica et Biophysica Acta. in press.