新しい生物素材としてのペルオキシゲナーゼP450

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14580616
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 城 宜嗣 独立行政法人理化学研究所, 生体物理化学研究室, 主任研究員 (70183051)
• 研究分担者: 杉本 宏 独立行政法人理化学研究所, 生体物理化学研究室, 研究員 (90344043) ; 金 美沙 独立行政法人理化学研究所, 生体物理化学研究室, 協力研究員
• キーワード: チトクロムP450 / 脂肪酸水酸化 / 過酸化水素 / ヘム酵素 / 酸素添加反応 / X線結晶構造解析

研究概要

過酸化水素を特異的且つ非常に効率よく利用し、脂肪酸のカルボキシル基近くの炭素原子(α位又はβ位)に過酸化水素の酸素原子を導入する、Bacillus subtilis由来のシトクロムP450(P450_<BSβ>)について、その反応機構と動的構造の関連を明らかにする事を目的としている。すでに、この酵素(鉄三価)の基質(パルミチン酸)結合型の結晶構造を明らかにしているので(JBC,278,9761-9767(2003))、基質認識機構解明のために、基質の結合していない酵素の結晶化を目指し、その精製法を検討した。また、基質認識に関与していると考えられる活性部位近傍のアミノ酸残基を、他のアミノ酸に置換したいくつかの変異体(R242K、R242A、F74L、V170F、F74L/V170F)、の発現系を調製し、それらの精製も試みた。
さらに、鉄に結合した配位子と基質との相互作用を調べる目的で、基質結合型Fe^<3+>酵素の結晶を、窒素雰囲気下、母液中でNa_2S_2O_4により還元した後に一酸化炭素(CO)をソーキングして、Fe^<2+>CO型酵素の生成を試みたが、その生成は確認できなかった。同様に、酵素反応中間体結晶の生成を目指し、Fe^<3+>酵素の結晶と過酸化水素との反応を試みたが、これも期待した成果は得られなかった。そこで、結晶中でFe^<2+>O_2型酵素を生成させ、クライオ条件下でのX線還元(Cryo-radiolysis)により反応中間体結晶を調製する為の準備を開始した。

研究成果

• [文献書誌] D.-S.Lee, A.Yamada, H.Sugimoto, I.Matsunaga, H.Ogura, K.Ichihara, S.Adachi, S.-Y.Park, Y.Shiro: "Substrate Recognition and Molecular Mechanism of Fatty Acid Hydroxylation by Cytchrome P450 from Bacillus subtilis : Crystallographic, Spectroscopic and Mutational Studies"J.Biol.Chem.. 278. 9761-9767 (2003)
• [文献書誌] H.Sawai, N.Kawada, K.Yoshizato, H.Nakajima, S.Aono, Y.Shiro: "Characterization of Heme Environmental Structure of Cytoglobin, A Fourth Globin in Human"Biochemistry. 42. 5133-5142 (2003)
• [文献書誌] S.Akimoto, A.Tanaka, K.Nakamura, Y.Shiro, H.Nakamura: "O2 Specific Regulation of the Ferrous Heme-based Sensor Kinase FixL from Sinorhizobium meliloti and Its Aberrant Inactivation in the Ferric Form"Biochem. Biophys.Res.Commun.. 304. 136-142 (2003)
• [文献書誌] S.Adachi, S.-Y.Park, J.R.H.Tame, Y.Shiro, N.Shibayama: "Direct Observation of Photolysis-induced Tertiary Structural Changes in Hemoglobin"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 100. 7039-7044 (2003)
• [文献書誌] M.Ishida, N.Dohmae, Y.Shiro, Y.Isogai: "Synthesis of Biotinylated Heme and Its Application to Panning Heme-binding Proteins"Anal.Biochem.. 321. 138-141 (2003)
• [文献書誌] H.Nakamura, H.Kumita, K.Imai, T.Iizuka, Y.Shiro: "ADP Reduces the Oxygen Binding Affinity of A Sensory Histidine Kinase, FixL : Possibility of the Enhanced Reciprocating Kinase Reaction"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 101. 2742-2746 (2004)