新規コレステロール結合プローブを用いた膜機能ドメイン(ラフト)の分子基盤の解析

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14580633
• 研究機関: (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団
• 研究代表者: 岩下 淑子 (財)東京都高齢者研究・福祉振興財団, 東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, 副参事研究員 (50111498)
• 研究分担者: 猪股 光司 財団法人東京都高齢者研究, 福祉振興財団・東京都老人総合研究所・生体膜機能研究グループ, 主任研究員 (30142649)
• キーワード: コレステロール / ラフト / コレステロール結合毒素 / T細胞 / 脂質マイクロドメイン

研究概要

我々は、これまでに、コレステロールに特異的に結合する毒素(θ毒素)を改変、無毒化することによってコレステロールに特異的なプローブ(BCθ)を作製し、BCθが脂質ミクロドメイン(ラフト)中のコレステロール密度の高い領域に選択的に結合することを見いだしている。従来、ラフトの生化学的解析には界面活性剤に不溶性の低密度膜画分が「ラフト画分」として用いられてきた。しかし、我々はBCθを用いた電子顕微鏡による観察から、「ラフト画分」にはコレステロールに富む膜とそうでないものが混在していることを見出した。このことは、組成の異なるラフトサブセットの存在、あるいはラフトとは特徴づけられない膜成分の混在を示すものと考えられる。そこで、BCθを用いたアフィニティ精製を行い、「ラフト画分」からコレステロールに富む膜を分離する試みを行った。まず、ビオチニル化したプローブ(BCθ)を結合させたT細胞(Jurkat細胞)から「ラフト画分」を調製した。次に、この画分にアビジンを結合させた坦体を加え、BCθを結合した膜断片のみを坦体に吸着させて分離した。吸着画分の膜断片は非吸着画分に比べコレステロール/リン脂質比が高く、また、脂質組成においても両者には差があることが示された。さらに、ラフトマーカーといわれているフロチリンや、Lck,FynおよびガングリオシドGM1の他に、LAT,PAG,Csk等のT細胞情報伝達に関わる分子群が吸着画分に回収された。一方、CD3やZAP-70、エズリン等は非吸着画分に回収された。このことから、「ラフト画分」中の特定の分子群がコレステロールに富む膜領域に局在することが強く示唆された。さらに、受容体刺激による活性化に伴って、コレステロールに富む膜領域に移行してくる分子群の存在が捉えられたことから、本分離法は情報伝達に伴うラフトの変動の解析にも有用と考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Ohno-Iwashita, Y. et al.: "Perfringolysin O, a cholesterol-binding cytolysin, as a probe for lipid rafts"Anaerobe. 10(2). 125-134 (2004)
• [文献書誌] Wada, S. et al.: "γ-Secretase activity is present in rafts, but not cholesterol-dependent"Biochemistry. 42(47). 13977-13986 (2003)
• [文献書誌] Heijnen, H.F.G.et al.: "Concentration of rafts in platelet filopodia correlates with recruitment of c-Src and CD63 to these domains"J.Thrombosis and Haemostasis. 1(6). 1161-1173 (2003)
• [文献書誌] Sugii, S. et al.: "Biotinylated theta toxin derivative as a probe to examine intracellular cholesterol-rich domains in normal and Niemann-Pick type C1 cells"J.Lipid Res.. 44(5). 1033-1041 (2003)
• [文献書誌] Nagafuku, M. et al.: "Reduction of glycosphingolipid level in lipid rafts affects an expression state and function of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins, but does not impair signal transduction via the T cell receptor"J.Biol.Chem.. 278(51). 51920-51927 (2003)
• [文献書誌] Moebius, W. et al.: "Recycling compartments and the internal vesicles of multivesicular bodies harbor most of the cholesterol found in the endocytic pathway"Traffic. 4. 222-231 (2003)