| 研究課題/領域番号 |
14580658
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能生物化学
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
小俣 義明 久留米大学, 医学部, 助教授 (20268840)
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| 研究分担者 |
野口 正人 久留米大学, 医学部, 教授 (10124611)
坂本 寛 久留米大学, 医学部, 講師 (70309748)
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| 研究期間 (年度) |
2002 – 2004
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| キーワード | ポルフィリン / ウロポルフィリノーゲン / ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素 / 先天性骨髄性ポルフィリン症 / ハイドロキシメチルビラン / ハイドロキシメチルビラン合成酵素 |
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| 研究概要 |
環状テトラピロールのポルフィリンは生命に必須な化合物の1つであるが、生物が生理的に利用するポルフィリンは4つのピロール環の置換基が分子の中心に対して対称には配置していない。この非対称性はポルフィリンやヘムの機能に重要な意味を持ち、生合成過程においてピロール化合物のポルフォビリノーゲンがハイドロキシメチルビラン合成酵素によって対称な形に順次縮合された後、ウロポルフィリノーゲンIII合成酵素(UROS)の作用でD環の反転を伴って環化することで決定づけられる。本研究ではUROSの反応機構の解明に寄与すべく、ヒト酵素の大腸菌での発現系を作成し精製酵素の性質を検討した。UROS遺伝子はヒト肝cDNAライブラリーからPCRによって増幅し、発現ベクターへ組み込んだ。発現させた酵素は溶菌後4℃でも活性が速やかに低下してしまったが、グリセリンの添加によって安定性の改善が見られた。精製はグリセリン存在下で行い、HPLC用カラムを用いて溶菌後48時間に終了できるようにした。精製酵素は今までに報告されている標品に比べて極めて高い熱安定性を示し、DTT或いはEDTAの添加によって更に安定性が増加した。このことから酸化に対して感受性の高い酵素であると考えられたのでチオール基の数と活性の関係を調べたところ、蛋白分子内部に埋もれているCys残基が活性に重要であることが判り、結晶構造からそれはCys73であると考えられた。これはUROS活性の低下しているポルフィリン症患者に共通して最も多く見られる変異がC73Rであることによっても支持される。化学修飾の結果から活性には塩基性アミノ酸の関与が考えられたので、想定される活性部位近傍のLys、Arg、His残基の変異酵素を作成して活性、K_m、k_<cat>を測定した。その結果から推定された基質の結合様式として、対面する2残基によって基質を挟み他はそれを周囲から支えていると考えられた。
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