組織特異的転写因子群、基本転写装置の生体内クロマチンへの結合状態の時間的解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14580686
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 池田 啓子 自治医科大学, 医学部, 講師 (10265241)
• キーワード: 時間生物学 / クロマチン / 筋分化 / MyoD / Myogenin遺伝子 / 遺伝子発現 / 転写因子

研究概要

研究目的
遺伝子情報発現機構の解明には時間生物学の観点を取り入れた解析が必要不可欠である。個体発生における組織・細胞の分化や、細胞内情報伝達応答に呼応した遺伝子発現制御は厳密な時間軸を有するDNAと蛋白質の相互作用である。本研究では、モデル系として筋肉培養細胞株を用い、分化刺激後種々のtime pointで筋分化特異的遺伝子(Myogenin遺伝子等)の発現と、制御因子の結合・因子の修飾とDNAの動態との相関を明らかにする。なお、これらの遺伝子発現を制御する転写因子は共通のMyoD、MEF2C、Six、Eyaである。
研究実施計画と成果
1 Nuclear Suspensionの準備
当初の計画ではマウス筋芽細胞株C2C12を用いる予定であった。しかしC2C12細胞では時間をおった分化後の形態や遺伝子発現(ノザン解析による)で再現性ある結果が得られなかったため、マウス繊維芽細胞にエストロゲンレセプタとMyoDの融合蛋白質が恒常的に導入されている細胞株を用いることとした。同細胞は、エストロゲン刺激後、MyoDが標的遺伝子に結合し、筋分化を開始し、種々の筋分化特異的遺伝子は再現性をよく発現した。同細胞からNuclear Suspensionを調製した。
2 各種抗体の作成
MyoD、Six、Eya、MEF2Cの特異抗体を作成した。Affinity精製もおこなった。基本転写因子の抗体は作成中である。
3 CHIPアッセイ
分化刺激後種々のtime pointで調製したNuclear Suspensionを用いMyoD、Six、Eya、MEF2C抗体を用いたCHIPアッセイをおこなった。さらに数回確認実験を予定している。
4 3D FISH
遺伝子側の動態を知るために、分化刺激後種々のtime pointでMyogenin遺伝子等の3 dimension FISHの系をたちあげた。分化に伴う遺伝子DNAの動態についての新たな知見が得られた。

研究成果

• [文献書誌] Ikeda, K.et al.: "The H1 and H2 regions of the activation domain of herpes simplex virion protein 16 stimulate transcription through distinct molecular mechanisms"Genes Cell. 7(1). 49-58 (2002)
• [文献書誌] Ozaki, H.et al.: "Impaired interactions between mouse Eyal harboring mutations found in patients with branchio-oto-renal syndrome and Six, Dach, and G proteins"J Hum Genet.. 47(3). 107-116 (2002)
• [文献書誌] Ikeda, K.et al.: "Molecular interaction and synergistic activation of a promoter by six, eya, and dach proteins mediated through CREB binding protein"Mol.Cell.Biol.. 22(19). 6759-6766 (2002)
• [文献書誌] Ikeda, K.et al.: "Degeneration of the amygdala/piriform cortex and enhanced fear/anxiety behaviors in sodium pumpplaha a2 subunit(Atp1a2) deficient mice"J.Neuroscience. (in press). (2003)