| 研究課題/領域番号 |
14580727
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
相見 良成 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 助手 (20231756)
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| 研究分担者 |
松尾 明典 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 助手 (20324585)
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| キーワード | pChAT / コリンアセチル基転位酵素 / 蛍光共鳴エネルギー転移 / FRET / スプライシング異型 / 定量PCR / 組織化学法 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、我々が新規に見いだしたコリン合成酵素のスプライス異型(pChAT)を対象にして、mRNAスプライシング異型の局在を弁別し検出するためのFRET現象を応用した組織化学法、すなわち「in situ FRET法」を確立し、組織特異的なChAT mRNAスプライス異型の発現パターンを形態学的に明らかにすることである。初年度はこの目的に沿い、手始めに試験管内でのスプライス異型の弁別検出を試みた。
具体的には、活性測定用に作製したpChATのmRNAの全長を組み込んだベクターを用い、これを増幅した後に、基礎実験用のDNA鋳型とした。スプライスジャンクションの部位に対してデザインした近接する2つの特異的オリゴDNAのそれぞれに異なる蛍光標識をつけFRETプローブとした。ライトサイクラーを用いた定量的PCR法により、このFRETプローブがpChATのmRNAを特異的に検出することを示した。すなわちpChATに対するPCRプライマーを用いてpChATのmRNAを増幅し、この増幅をFRET法で定量できることを示した。現在、組織より得られたmRNAを鋳型として上記の方法を試みているが、感度が充分でないという問題に対して、実験条件の最適化等を模索しているところである。
また一方、これまでpChATの局在を免疫組織化学法にて明らかにしてきたが、本研究のin situ FRET法での弁別検出のための基礎データとして、腸管では従来のChATとpChATが別々の神経に存在し、かつ隣接して混在することを多重免疫組織化学法にて明らかにした。これまで単一の神経節での混在は明らかでなく、本研究を推進していく上で、対象臓器を腸管とすべきであるとの知見を得た。この結果は国際共同研究として論文発表した。
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