プロテインキナーゼCの神経可塑性制御における役割-GFP標識PKCを用いた研究-

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14580743
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 酒井 規雄 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (70263407)
• 研究分担者: 関 貴弘 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (50335650) ; 天野 託 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (10294547) ; 松林 弘明 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (60165850)
• キーワード: プロテインキナーゼC / 蛋白質リン酸化 / トランスジェニックマウス / 神経可塑性 / 小脳プルキンエ細胞 / ライブイメージング

研究概要

(1)初代培養神経細胞あるいは、器官培養(スライスカルチャー)神経細胞に、PKC-GFP発現ウイルスベクターを用いて、各種PKC-GFPを遺伝子導入しPKCターゲティング、PKCの神経特異的な働きを解析する。
PKC-GFP発現ウイルスベクターを用いて、培養神経細胞にPKC-GFPを発現させトランスロケーションを観察する手法を確立した。ζPKCは、刺激依存性に軸索の分岐部に集まる傾向が見られた。また、ラットのパーキンソン症候群の原因と予想されるtruncated γPKCを神経細胞に発現させたところ、斑点状の局在を示し、発現した細胞は脆弱性を示し、あるいは、突起が多数になる傾向が見られた。
(2)Tet制御システムを用いたγPKC-GFP,εPKC-GFPトランスジェニックマウスの解析
neuron specific enolase promoterの下流にtTAを発現するマウス(NSE-tTA)、calcium calmodulin kinasell promoterの支配下にtTAを発現するマウス(CamKll-tTA)と掛け合わした際のPKC-GFPの発現部位の特徴について解析した。また、作成したトランスジェニックマウスにおいて、Tet制御システムは正常に働くことを確認した。現在、NSE-tTA xγPKC-GFPバイトランスジェニックマウスから小脳生スライスを作製し、γPKC-GFP発現小脳プルキンエ細胞において、2光子励起レーザー顕微鏡や高感度CCDカメラを用いて、γPKCのトランスロケーションの観察を試みた。各種グルタミン酸受容体作用薬、あるいは電気刺激により、γPKCのトランスロケーションが観察可能で刺激に応じてPKC-GFPのトランスロケーションが伝播していくライブイメージをとらえることが可能になった。また、CamKll-tTAマウスとγPKC-GFPマウスを掛け合わせ、海馬を含む前脳全体にγPKC-GFPが発現するマウスにおいてもγPKCのトランスロケーションの観察を試みを行っている。このように、我々の作成したマウスはターゲティングを指標にPKCの神経系での機能を解析するツールとなるだけでなく、神経の興奮の伝播を蛋白質レベルで明瞭にイメージングすることが出来る新しい神経機能解析のための遺伝子操作動物であると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Kashiwagi, K, 他: "Importance of C1B domain for lipid messenger-induced targeting of PKC"J. Biol. Chem.. 277. 18037-18045 (2002)
• [文献書誌] Sakai, N, 他: "Inducible and brain region specific CREB transgenic mice"Mol. Pharmacol.. 61. 1453-1464 (2002)
• [文献書誌] Nishizaki, T, 他: "A new neuromodulator pathway with a glial contribution mediated via A2a adrenergic receptors"Glia. 39. 133-147 (2002)
• [文献書誌] Sakai, K, 他: "The silencer activity of the novel human serotonin transporter linked polymorphic region"Neurosci. Lett.. 327. 13-16 (2002)
• [文献書誌] Seki, T, 他: "Adenoviral gene transfer of aspartoacylase into the tremor rat, a genetic model of epilepsy, as a trial of gene therapy for inherited epileptic disorder"Neurosci Lett. 328. 249-252 (2002)
• [文献書誌] Goerke, A, 他: "Induction of apoptosis by Protein kinase C delta is independent of its kinase activity"J. Biol. Chem.. 277. 18037-18045 (2002)
• [文献書誌] Kodama, N, 他: "Effects of D-Fraction, a polysaccharide from Grifola frondosa on tumor growth involve activation of NK cells"Biol. Pharm. Bull.. 25. 1647-1650 (2002)
• [文献書誌] Irie, N., 他: "Subtype-and species-specific knockdown of PKC using short interfering RNA"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 298. 738-743 (2002)
• [文献書誌] Newton, S.S., 他: "Inhibition of cAMP response element-binding protein or dynorphin in the nucleus accumbens produces an antidepressant-like effect"J. Neurosci. 2002. 24. 10883-10890 (2002)
• [文献書誌] Kiura, Y., 他: "Involvement of Ca^<2+> channels in abnormal excitability of hippocampal CA3 pyramidal cells in Noda epileptic rats"J. Pharmacol. Sci.. 91. 137-144 (2003)
• [文献書誌] Sakai, K., 他: "Novel Variant of murine serotonin transporter mRNA and the promoter activity of its upstream site"Neurosci Lett. (印刷中). (2003)