微小管機能の障害によるアポトーシスへのカルシニューリンの関与についての研究

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14580746
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 山本 秀幸 熊本大学, 医学部, 助教授 (60191433)
• キーワード: アポトーシス / FK506 / カルシニューリン / 癌細胞 / サイクロスポリンA / タキソール / 脱燐酸化反応 / Bcl-2

研究概要

抗癌剤であるタキソールは微小管重合作用を有し、細胞分裂を抑制することでアポトーシスを誘導することが知られている。この誘導作用には、Bcl-2の燐酸化反応が関与していることが報告されていた。しかしBcl-2の脱燐酸化反応とアポトーシスの研究はほとんどなされていない。今回、培養ヒト膀胱癌細胞を用いてBcl-2の脱燐酸化反応に対するカルシニューリンの関与について検討した。実験には悪性度の高いT24細胞と悪性度の低いKK47細胞の二種類の癌細胞を使用した。1.WST-1法による細胞死の検討では、T24細胞はタキソールに対して抵抗性を有し、IC50は406nMを示した。カルシニューリン阻害剤であるサイクロスポリンA(CsA)とFK506の添加によりIC50は、それぞれ78.8nMと135.3nMに減少した。KK47細胞ではCsAとFK506の添加効果は弱くしか認められなかった。2.両細胞にカルシニューリンが存在し、その活性は、CsAやFK506の添加により完全に消失した。3.ヘキスト染色とFACScanを用いたサブG1測定法およびカスパーゼ活性測定法により、タキソールによる両細胞のアポトーシスが観察された。さらに、アポトーシスはカルシニューリン阻害剤の添加により増強された。4.Bcl-2の燐酸化反応については燐酸化特異抗体を用いた免疫ブロット法により検討した。タキソール処理によるBcl-2の燐酸化反応は、CsAやFK506の添加により増強された。これらの結果は、カルシニューリンがBcl-2の脱燐酸化反応に関与し、タキソールによるアポトーシスを抑制することを示唆している。最近、カルシニューリンの培養細胞での発現系を開発した。今後、この系を用いてカルシニューリン発現によるアポトーシスの抑制作用を詳細に検討する予定である。

研究成果

• [文献書誌] Yamamoto, H.: "Phosphorylation of microtubule-associated protein tau by Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II in its tubulin binding sites"Arch. Biochem. Biophys.. 408. 255-262 (2002)
• [文献書誌] Nomura, T.: "Enhancement by cyclosporin A of taxol-induced apoptosis of human urinary bladder cancer cells"Urological Res.. 30. 102-111 (2002)
• [文献書誌] Inui, S.: "BCR signal through α4 is involved in S6 kinase activation and required for B cell maturation including isotype switching and V region somatic hypermutation"J. Int. Immunology. 14. 177-187 (2002)
• [文献書誌] Kanasaki, H.: "Differential regulation of pituitary hormone secretion and gene expression by thyrotropinreleasing hormone. a role for mitogen-activated protein kinase signaling cascade in rat pituitary GH3 cells"Biol. Reprod.. 67. 107-113 (2002)
• [文献書誌] Kanasaki, H.: "Regulation of gonadotropin a subunit gene expression by dopamine D_2 receptor agonist in clonal mouse gonadotroph αT3-1 cells"Biol. Reprod.. 67. 1218-124 (2002)
• [文献書誌] Kono, Y.: "MCM3-binding GANP DNA-primase is associated with a novel phosphatase component G5PR"Genes to Cells. 7. 821-834 (2002)
• [文献書誌] 山本秀幸: "Ca^<2+>/カルモデュリン依存性プロテインキナーゼIIの細胞内局在機構と生理機能"蛋白質・核酸・酵素. 47. 241-247 (2002)
• [文献書誌] Yamamoto, H.: "Involvement of Ca^<2+>/calmodulin-dependent phosphorylation of synapsin I in insulin exocytosis"J. Pharmacol. Sci.. (in press). (2003)