|
平成14年度に私はマウス・カスパーゼ-12の特異的結合因子、MAGE-3(melanoma associated antigen-3)を同定した。MAGE-3はマウス、ヒト共通に存在することから、ヒト細胞においてカスパーゼ-12オーソログと結合し、アポトーシス制御に関わる可能性を追究した。
1.小胞体ストレスに対するMAGE-3の効果の検討。数種類のヒト細胞株を用い、MAGE-3を高発現させたトランスフェクタントを作製したが、小胞体ストレスに対する感受性に変化が見られなかった。小胞体ストレス誘導性アポトーシスに対するカスパーゼ-12への依存度が低い細胞株ではMAGE-3の効果が見えない可能性が考えられた。もともとMAGE-3を発現している細胞株ではMAGE-3がアポトーシス制御に何らかの機能を果たしている事を仮定し、アンチセンスRNAやアンチセンスcDNAによってMAGE-3量を低下させたところ、細胞によっては小胞体ストレスに対する感受性が有意に上昇する結果を得た。今後は、感受性の変化した細胞株に対してカスパーゼ-12の探索を進めていきたい。
2.免疫共沈降法による探索。MAGE-3にFLAGタグ配列を付与したものをトランスフェクションによりヒト細胞株293Tで大量発現させた。トランスクェクタントから細胞抽出液を調製後、FLAGタグに対する特異的抗体によってMAGE-3を沈降させた。MAGE-3と共に沈降してくる蛋白質はSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による解析で20種以上検出された。再現性よく沈降してくる蛋白質については質量分析法によるアミノ酸配列の推定と蛋白質の同定を試みた。現時点ではカスパーゼ類似蛋白質は検出されていないが、解析したものの多くは小胞体内外に存在する蛋白質である事から、第二の結合因子が含まれている可能性についても検討している。
|
