ナノテクノロジーによる超微小HPLCの作製とプロテオーム高速解析系への適用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14655309
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 植田 充美 京都大学, 工学研究科, 助教授 (90183201)
• キーワード: ナノテクノロジー / ハイスループット / DNAライブラリー / 細胞表層工学 / HPLC / タンパク質ライブラリー / コンビナトリアル・バイオエンジニアリング / プロテオーム

研究概要

既知のDNA情報を機能タンパク質に変換したり、ランダムなDNA情報からこれまでに存在しなかったタンパク質を創製したりする潜在的な能力のある技術である細胞表層デイスプレイという分子ツールを開発し、これを用いたコンビナトリアル・バイオエンジニアリングを展開してきた。遺伝子のコードするタンパク質のこれまでの発現系は、タンパク質を純粋にとりだすためには、細胞を破砕したり濃縮したり、種々のカラムクロマトグラフィー操作も必要とする。一方、細胞の表層にタンパク質を発現デイスプレイする系では、デイスプレイされた細胞を一つの支持体として、提示されたタンパク質の機能解析ができ、タンパク質のアミノ酸配列分析を待たずに、PCR法などの併用により、導入されたDNAの配列から提示されたタンパク質のアミノ酸配列が決定できる。このように、細胞表層デイスプレイの手法は、DNA情報と機能タンパク質との解析のいわゆる距離を一気に短縮させた。また、ナノテクノロジーによって開発されたゾル・ゲル法によるシリカ一体型モノリス担体がHPLCをキャピラリー化できることがわかったので、この特性を利用して微小化HPLCの作製を行い、ハイスループットデバイスを作製した。一方、種々の細胞のmRNAから作製したcDNAなどを鋳型にして、ランダムなプライマーやエラーの多いポリメラーゼを用いてランダムなDNAライブラリーを作製し、【酵母細胞表層デイスプレイ(Cell Surface Engineering)】技術を用いて、細胞表層に機能性タンパク質分子ライブラリーとして提示した、いわゆるタンパク質ライブラリーを調製することに成功した。このタンパク質ライブラリーの活性検索を微小化HPLCで行うための最適化を行なった。

研究成果

• [文献書誌] S.Shiraga et al.: "Construction of the combinatorial library of Rhizopus oryza lipase mutated in the lid domain by displaying on yeast cell surface"J.Mol.Catalysis. 17-3-5. 167-173 (2002)
• [文献書誌] 植田充美: "コンビナトリアル・バイオエンジニアリングによるゲノムを超えた新機能の創出"科学と生物. 40・4. 251-257 (2002)
• [文献書誌] W.Zou et al.: "Screening of a molecule endowing Saccharomyces cereisiae with M-nonane-tolerance from a combinatorial random protein library"Appl.Microbiol.Biotechnol.. 58・5. 806-812 (2002)
• [文献書誌] 植田充美: "酵母細胞表層工学からのコンビナトリアル・バイオエンジニアリング"化学と教育. 50・8. 559-563 (2002)
• [文献書誌] T.Matsumoto et al.: "Construction of yeast strains with high cell-surface lipase activity using novel display systems based on Flolp functional domain"Appl.Environ.Microbiol.. 68・9. 4517-4522 (2002)
• [文献書誌] 芝崎誠司: "インテリジェントな細胞センサー"バイオサイエンスとインダストリー. 61・1. 27-30 (2003)
• [文献書誌] 植田充美: "コンビナトリアル・バイオエンジニアリング -情報から機能の創造をめざして-"化学同人. 213 (2003)