| 研究課題/領域番号 |
14656069
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
杉山 淳司 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (40183842)
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| 研究分担者 |
馬場 啓一 京都大学, 木質科学研究所, 助手 (20238223)
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| キーワード | ポストゲノム / セルロース合成酵素 / 酢酸菌 / 昆虫細胞発現系 / CesA / リコンビナントタンパク質 / 電子線結晶学 |
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| 研究概要 |
セルロース合成酵素を高分解能で三次元構造解析するためにHis-tagを付加したリコンビナントセルロース合成酵素を大量に生産することを目的とした。またこれを精製する条件を検討した。酢酸菌セルロース合成酵素オペロンの触媒サブユニットBcsAに相当する遺伝子をPCRにより増幅しバキュロウイルスベクターに導入した。トランスファーベクターの作成の際、セルロース合成酵素にHis-tagが付加されるよう設計した。このウイルスを昆虫細胞Sf9にトランスフェクションし、リコンビナントセルロース合成酵素を発現させることに成功した。ウイルスの感染から一定時間ごとに回収した細胞を電気泳動してウエスタンブロッティングすることにより、リコンビナントセルロース合成酵素が最も多量に発現されるウイルスの感染時間を検討した。その結果48時間から60時間で最も大量に合成されることが確認された。また膜画分を作製して目的タンパク質が膜で発現していることを確認した。膜画分の洗いに最適な条件を検討したところ、目的タンパク質の流出が少ない0.2Mの炭酸ナトリウムを用いること、またバッファーにはPBSが適していることが判った。洗浄後の可溶化については、7種類の界面活性剤をいくつかの濃度で試験したところ、n-Decyl-β-D-maltosideが適していると思われた。また試料を凍結させると洗浄や可溶化に悪影響を及ぼすことも判った。
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