| 研究課題/領域番号 |
14656099
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
山之上 稔 神戸大学, 農学部, 助教授 (30182596)
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| 研究分担者 |
服部 昭仁 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (50125027)
岩永 史朗 神戸大学, 農学部, 助手 (20314510)
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| キーワード | 食肉 / 熟成 / パラトロポミオシン / コネクチン / 遺伝子クローニング / 遺伝子発現 |
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| 研究概要 |
熟成中の食肉軟化機能を有するパラトロポミオシンおよびパラトロポミオシンと相互作用するコネクチンタンパク質のDNAを微生物に導入、大量発現させる目的のため、本年度は鶏パラトロポミオシンおよびコネクチンの遺伝子を、A)PCR法による遺伝子増幅、及びB)抗体によるcDNAライブラリスクリーニング法の2方法を用いてクローニングすることを試みた.
A)PCR法による遺伝子増幅結果:
パラトロポミオシンの部分アミノ酸配列および既知のヒト心筋コネクチンA-I接合部領域のアミノ酸配列から複数の縮重オリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして合成し、鶏胸筋cDNAライブラリを鋳型としてPCRを行った。その結果パラトロポミオシンについては増幅物を得、塩基配列を決定したが、相同性検索の結果筋原線維タンパク質トロポミオシンα鎖のDNA断片であった。一方コネクチンについてはヒト心筋コネクチンと約80%の高い相同性を示すDNA断片を得た。このDNAから推定される鶏コネクチンA-I接合部領域のアミノ酸配列の知見について第101回日本畜産学会大会で発表予定である。またこのDNAの大腸菌での発現を試みている。
B)抗体によるcDNAライブラリスクリーニング結果:
抗パラトロポミオシンポリクローナル抗体および抗コネクチンモノクローナル抗体を用いて、それぞれ鶏胸筋cDNAライブラリをスクリーニングした。その結果抗パラトロポミオシン抗体で1クローンを同定したが、その塩基配列は核タンパク質をコードするmRNAと一致した。一方抗コネクチン抗体ではこれまでのところ陽性を示すクローンは得られていない。
上記のように、現在までに目的とする遺伝子の一部を得られたが、今後両タンパク質の遺伝子クローニングを継続するとともに、得られたDNAの大腸菌への導入、大量発現から発現タンパク質の精製へと進める予定である。
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