| 研究課題/領域番号 |
14656099
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
山之上 稔 神戸大学, 農学部, 助教授 (30182596)
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| 研究分担者 |
服部 明仁 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (50125027)
岩永 史郎 神戸大学, 農学部, 助手 (20314510)
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| キーワード | 食肉 / 熟成 / パラトロポミオシン / コネクチン / 遺伝子クローニング / 遺伝子発現 |
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| 研究概要 |
熟成中の食肉軟化機能を有するパラトロポミオシンおよびパラトロポミオシンと相互作用するコネクチンタンパク質の遺伝子を微生物に導入、大量発現させる目的で、昨年度PCR法で増幅した鶏コネクチン遺伝子断片をクローニングし、その塩基配列を決定した。本年度は、1)鶏コネクチン遺伝子断片を大腸菌に導入し、大量発現を試みた。また昨年度に継続して、2)鶏パラトロポミオシンのcDNA決定を試みた。
1)塩基配列から推定される鶏コネクチン遺伝子断片のアミノ酸配列は295AAであり、ヒト心筋コネクチンのドメイン構造を基にするとI51ドメインの一部からI52、I53、およびI54ドメインの一部におよび、パラトロポミオシンが局在する筋節A-I接合部に相当するコネクチン領域を構成している。コネクチン断片の大腸菌での発現のため、決定した塩基配列からI52およびI53ドメインをコードする遺伝子をPCR法で増幅した。増幅遺伝子をpET-22bベクターに組込み、大腸菌Origami(DE3)に導入後発現誘導した。菌体破砕後遠心分離した上清中に、いずれも約15 kDaの組換え体I52およびI53ドメインの顕著な増加が認められ、両ドメインの大腸菌での発現が確認された。上清をゲルろ過法に続き疎水クロマトグラフィー法で分離した結果、組換え体I52およびI53ドメインはSDS-PAGEゲル上でいずれも単一バンドとして精製された。両組換え体ドメインのN末端アミノ酸配列は塩基配列から推定されるアミノ酸配列に一致した。これらの結果、コネクチンドメイン遺伝子の大腸菌での発現から、発現した組換え体コネクチンドメインの精製までの系が確立された。
2)抗パラトロポミオシンポリクローナル抗体を用いて、胸筋cDNAライブラリのスクリーニングを継続しているが、これまでのところ陽性を示すクローンは得られておらず、鶏パラトロポミオシンのcDNA決定に至っていない。
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