オーファン受容体リガンドの新しい高感度アッセイ法による探索

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14657021
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 木村 定雄 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (40134225)
• 研究分担者: 諸井 佳代子 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助手 (80110352) ; 西山 真理子 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助手 (00092081) ; 粕谷 善俊 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (70221877)
• キーワード: Gタンパク質共役受容体 / GPCR / オーファン受容体 / 生理活性ペプチド / ボンベシン受容体

研究概要

本研究は、独自の新しいアッセイ方法を導入し、リバース薬理学的方法により、新規生理活性ペプチドを探索し、構造決定することを目的とする。平成14年度は、(1)3T3細胞は細胞内カルシウム測定において、刺激を受けると強いシグナルを発生する特徴を持つので、オーファンボンベシン受容体遺伝子BRS3を安定発現する2種の3T3細胞の調製を行った。BRS3を安定発現する3T3細胞(BRS3-3T3)および高感度化を可能にするGqを安定発現する3T3にBRS3遺伝子を導入した細胞(BRS3-Gq-3T3)を作製した。(2)上記2種のBRS3発現細胞は、ボンベシン受容体に対して非特異的な合成BRS3リガンドを用いると、細胞内Ca濃度変化によるアッセイでは共にEC50値が約1nMであり、100pMでも検出可能となり非常に高感度であった。また、合成BRS3リガンドのみに特異的なクローン細胞とニューロメジンB/ニューロメジンC/合成BRS3リガンドのすべて応答する非特異的クローン細胞を樹立した。(3)リガンド探索用のペプチドライブラリーとして、脳、視床下部、胃、心臓の抽出物を作製した。(4)96サンプルを同時に測定可能なハイスループットスクリーニング装置(浜松ホトニクス:FDSS3000)を用いて、HPLCによる分離と細胞内カルシウム濃度アッセイ法によるリガンドスクリーニングを組み合わせて、現在、新規リガンドを探索中である。これまでにNMC、NMB、GRPを単離した。

研究成果

• [文献書誌] Takanami-Ohnishi Y, Amano S, Kimura S, Asada S, Utani A, Maruyama M, Osada H, Tsunoda H, Irukayama-Tomobe Y, Goto K, Karin M, Sudo T, Kasuya Y: "Essential role of p38 mitogen-activated protein kinase in contact hypersensitivity"J. Biol. Chem.. 277. 37896-37903 (2002)
• [文献書誌] Sato M, Moroi K, Nishiyama M, Zhou J, Usui H, Kasuya Y, Fukuda, M, Kohara, Y, Komuro, I, Kimura, S: "Characterization of a novel C. elegans RGS protein with a C2 domain-Evidence for interaction between C2 domain and Galfaq subunit-"Life Sciences. (印刷中). (2003)