オーファン受容体リガンドの新しい高感度アッセイ法による探索

2003 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14657021
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 木村 定雄 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (40134225)
• 研究分担者: 諸井 佳代子 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助手 (80110352) ; 西山 真理子 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助手 (00092081) ; 粕谷 善俊 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (70221877)
• キーワード: GPCR / 生理活性ペプチド / ゲノム構造 / リガンド / リガンド予測

研究概要

本研究は、独自のGPCRリガンドライブラリー作製と新しいアッセイ方法を導入し、新規生理活性ペプチドリガンドを探索することを目的とする。平成15年度は、(1)ゲノム構造Bankに登録されたDNA構造を用いて、1)独自のコンピューター「検索プログラム」により、ゲノム情報からG蛋白質共役受容体(GPCR)のリガンドとなる生理活性ペプチド候補を網羅的に抽出し、(2)994個の活性ペプチド候補をすべて化学合成し、(3)多数のGPCRを内在的に発現する細胞(組織)に作用させて特異的及び非特異的活性測定による新規GPCRリガンドのスクリーニングを行った。このGPCRペプチド性リガンド候補の化学合成は、生体内に微量しか存在しない生理活性ペプチドを大量に合成して、従来のGPCR刺激後の細胞内の下流シグナルを増幅するのど対照的な受容体上流の増幅を試みるものであり、強度のシグナルを生じ、精度よくGPCRリガンドを同定することが可能である(ペプチドゲノミクス解析の試み)。非特異的活性測定法として、オーファンGPCRを発現させた細胞や約20種類の種々の細胞に蛍光指示薬fura-2/AMを取り込ませ、ペプチドリガンド候補による細胞内Ca濃度変化を蛍光細胞内Caシグナル測定装置により96個同時に測定した.また、血管平滑筋、輸精管、回腸平滑筋などの組織をマグヌス管法にて種々の濃度のペプチドの収縮・弛緩を測定した。その結果、ゲノム構造から予測したリガンド候補994個の合成ペプチドより、総計34種類の既知ペプチドを検出した。一方、新規活性ペプチド3種類を検出した。現在、その新規活性ペプチドの遺伝子を取得し、生体内組織分布の解析および機能解析を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Sato M, Moroi K, Nishiyama M, Zhou J, Usui, H, Kasuya Y, Fukuda M, Kohara Y, Komuro I, Kimura S: "Characterization of a novel C. elegans RGS protein with a C2 domain - Evidence for interaction between C2 domain and Galfaq subunit"Life Sciences. 73. 917-932 (2003)