G蛋白質共役型受容体発現調節に関わる補助因子をターゲットとした創薬研究の基盤確立

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14657026
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 谷山 紘太郎 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (70030898)
• 研究分担者: 上園 保仁 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (20213340) ; 貝原 宗重 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (40274633)
• キーワード: 創薬 / GABA-B受容体 / heterodimerization / Xenopus oocyte / G蛋白共役型受容体 / FRET / Electrophysiology / heterologous expression

研究概要

本研究は、クローン化GABA-B受容体、AM受容体(CRLR+RAMPs)を発現させた細胞を用いて、3つの異なるアッセイ系を用いて、すなわち、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いて可視化し、さらに(3)GABA-B, AM受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能的GPCR形成の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである(平成14年)。これらのシステムの最適化の後、受容体複合体化・多量体化に影響を与える薬物のスクリーニングが可能であるかどうかを検討し、検討可能なシステムであるとして確立されれば、「GPCRの多量体化・複合体化を調節する薬物」の探索と創薬を行うための基礎データをこの研究期間内に集積する(平成15年)予定である。
(1)については、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得ている。またpreliminaryではあるが、ある種のHeat shock proteinの活性阻害薬が細胞膜への受容体の移動、並びにdimerizationを抑制するという知見を得ている。(2)については、まだ発現の最適化が完全には行われておらず、さらに検討を要している。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB-2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討している。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ詳細に解析を試みている。これまでに、GABAの結合にはGABAB-1Rが重要であり、機能発現にはGABAB-2Rが必要であるという興味深い知見を得ている。これらのことは、「機能的であるためにDimerizationを必要とする受容体」の創薬において、1)Dimerizationに影響を与える薬物、2)受容体へのリガンド結合に影響を与える薬物(現在まで専らこの点に注目して薬物の開発が行われてきた)、3)機能活性をもつ部位に影響を与える薬物に分けて薬物開発が可能となるということを示唆している。残り1年でこの点について検討を行い、来年度研究終了時までには当初の目的を完遂できるものと考えている。

研究成果

• [文献書誌] Shiga, Y., Uezono, Y., Kaibara M et al.: "The inhibitory effects of tramadol of muscarinic receptor-induced responses in Xenopus oocytes expressing cloned M3 receptors"Anesthesia and Analgesia. 95. 1269-1273 (2002)
• [文献書誌] Shiraishi, M., Uezono, Y et al.: "Inhibitory effects of tramadol on nicotinic acetylcholine receptors in adrenal chromaffin cells and in Xenopus oocytes expressing α7 receptors"British Journal of Pharmacology. 136. 207-216 (2002)
• [文献書誌] Matsuoka, I., Uezono, Y et al.: "Involvement of a rapid and localized adenosine formation by ecto-nucleotidases in adenine nucleotide-induced activation of adenosine A2B receptors expressed in Xenopus oocytes"Molecular Pharmacology. 61. 606-613 (2002)
• [文献書誌] Matsuo K, Kaibara M, Uezono Y, Taniyama K et al.: "Involvement of cholinergic neurons in orexin-induced contraction of guinea pig ileum"European Journal of Pharmacology. 452(1). 105-109 (2002)
• [文献書誌] Kaibara M, Taniyama K et al.: "Identification of human Kir2.2 (KCNJ12) gene encoding functional inward rectifier potassium channel in both mammalian cells and Xenopus oocytes"FEBS Letters. 531(2). 250-254 (2002)
• [文献書誌] Okamoto, T., Uezono, Y et al.: "Inhibitory effects of ketamine and pentobarbital on substance P receptors expressed in Xenopus oocytes"Anesthesia and Analgesia. (In Press). (2003)