多光子顕微鏡を用いた細胞内小器官レベルのナノサージェリー

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14657059
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 小山田 正人 京都府立医科大学, 医学部, 助教授 (30183255)
• 研究分担者: 中村 收 大阪大学, 大学院・生命機能研究科, 教授 (90192674)
• キーワード: 多光子顕微鏡 / ナノテクノロジー / カルシウム波 / レーザー顕微鏡 / 細胞小器官 / 非線形光学 / 小胞体 / ナノサージェリー

研究概要

1)近赤外超短レーザー照射による細胞内カルシウム波の誘導
近赤外超短パルスレーザーを対物レンズによって細胞質に集光し、1/125秒間のみ細胞に照射することによって、焦点部位にカルシウム指示薬fluo-4の蛍光強度の上昇が発生し、そこから細胞内に波状に伝搬する現象(カルシウム波)が観察された。レーザー強度を変化させ、細胞内カルシウム波の発生確率を解析することにより、カルシウム波の発生確率はレーザーの平均強度に依存することが明らかとなった。すなわち、レーザーの平均強度が20mW以下ではカルシウム波は発生せず、20mWと50mWの間ではレーザー強度の増加に伴った発生確率が増加した。一方、連続発振レーザー(波長780nm)を用いて平均強度300mWで照射した場合は、細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。これらの結果より、近赤外超短レーザー照射による細胞内カルシウムの局所的上昇には多光子吸収などの非線形光学過程が関与していることを明らかにした。
2)近赤外超短レーザー照射による細胞内カルシウム波発生メカニズムの解析
細胞外のカルシウムイオンを除去する実験、フォスフォリパーゼCの阻害剤(U-73122)を用いた実験、およびthapsigarginによって細胞内カルシウムストアーを枯渇させる実験により、近赤外超短レーザー照射による細胞内カルシウム波発生には、小胞体のカルシウムストアーが関与していることを明らかにした。すなわち、0.1mM EGTAの負荷によって、細胞外のカルシウムを取り除いても、また、フォスフォリパーゼCを阻害してもカルシウム波の発生頻度は変化しなかったのに対して、thapsigarginによって細胞内カルシウムストアーを枯渇させるとカルシウム波の発生が有意に減少した。さらに、レーザー照射部位によるカルシウム波の発生頻度を、細胞質、核、細胞膜について比較する実験によって、核に比べて細胞膜と細胞質に照射した場合に、高い頻度でカルシウム波が発生することが分かった。また、低いレーザー平均強度(30mW)で繰り返し照射した場合には、カルシウム波の発生も繰り返し起こることが観察された。
以上より、近赤外超短レーザーを用いた生細胞内局所刺激によってカルシウム波を発生させることができることを見いだした。多光子吸収過程をはじめとする非線形光学を生きた細胞や組織に応用することにより、ナノレベルの細胞内刺激や阻害の可能性を開く実験結果を得た。

研究成果

• [文献書誌] Oyamada, Y., et al.: "Dominant-negative connexin43-EGFP inhibits calcium-transient synchronization of primary neonatal rat cardiomyocytes"Exp.Cell Res.. 273. 85-94 (2002)
• [文献書誌] Oyamada, M., et al.: "Regulation of gap junction protein (connexin) genes and function in differentiating ES cells"Methods Mol Biol : Embryonic Stem Cells : Methods and Protocols. 185. 63-69 (2002)
• [文献書誌] Tanaka, H., et al.: "Excitation-Dependent Intracellular Ca(2+) Waves at the Border Zone of the Cryo-injured Rat Heart Revealed by Real-time Confocal Microscopy"J.Mol.Cell.Cardiol.. 34. 1501-1512 (2002)
• [文献書誌] Hirakawa, H., et al.: "Loss and recovery of the blood-nerve barrier in the rat sciatic nerve after crush injury are associated with expression of intercellular junctional proteins"Exp.Cell Res.. 284. 194-208 (2003)
• [文献書誌] Tsujii, E., et al.: "In situ visualization of the intracellular Ca2+ dynamics at the border of the acute myocardial infarction"Mol.Cell. Biochem.. (印刷中).
• [文献書誌] Suzuki, T., et al.: "Expression of gap junction protein connexin43 in the adult rat cochlea : Comparison with connexin26"J.Histochem.Cytochem.. (印刷中).
• [文献書誌] 小山田正人, 小山田ゆみ子: "病気と小器官(森道夫編) ギャップ結合チャネル病-細胞社会のネットワーク障害-"文光堂. 236 (2002)