| 研究課題/領域番号 |
14657136
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
佐藤 信紘 順天堂大学, 医学部, 教授 (90028358)
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| 研究分担者 |
池嶋 健一 順天堂大学, 医学部, 講師 (20317382)
竹井 謙之 順天堂大学, 医学部, 助教授 (10306954)
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| キーワード | 肝線維化 / 肝星細胞 / inverse genomics / siRNAライブラリ |
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| 研究概要 |
前年度では、肝星細胞の機能変化、細胞死の過程で、責任遺伝子を切断し、機能変化を検出するための方策としてハイブリッド・リボザイムライブラリを用いたが、さらにライブラリとしての汎用性と性能を上げ、かつ切断効率を確実にするため、RNA干渉法(RNA interference)による遺伝子ノツクダウンを企図し、siRNA発現ライブラリを搭載したプラスミドベクターの使用に切り替えた。
培養星細胞のグリオトキシンにより惹起されるアポトーシス・ネクローシスは、PIとアネキシンVの2重染色によりFACSで検出する系を用いた。このシステムでは生存細胞をFACSを用いて分取することが可能である。グリオトキシン濃度依存性に星細胞にアポトーシスが惹起されること、アポトーシスは急速に2次性ネクローシスに進展すること、さらに星細胞が完全にアポトーシスで死滅するためには、従来報告されている濃度より高い10-1000nMのグリオトキシン濃度が必要であることを観察した。この条件下におけるグリオトキシン誘導星細胞アポトーシス系に前記のsiRNA発現ライブラリをトランスフェクトし、生存細胞のセレクションを行った。培養株化星細胞へのライブラリプラスミド導入効率は比較的低く(<10%)、リポフェクション法に加え、電気穿孔法などにより、導入効率を高める工夫を行っている。また、現時点で得られた少数のポジティブクローンはカスパーゼ等既知の遺伝子をコードしており、さらにノックダウン遺伝子の特定を進めることにより、星細胞アポトーシスの惹起機序に関わる遺伝子の探索を実施中である。
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