| 研究概要 |
1)培養ヒト皮膚線維芽細胞からmRNAを抽出し,発現しているヒアルロン酸合成酵素(HAS(HAS1,HAS2,HAS3))の各遺伝子full-length cDNAを調整した。これをBluescript vectorにサブクローニングして,大量に調整し,これを用いて,その塩基配列をautosequencorで解読した。次に各cDNAをBluescript vectorから再度切り出し,Neomycin耐性遺伝子の挿入されたpCY4Bタンパク質発現ベクター(pCY4B-Neo)(大阪大学 宮崎純一教授より分与)に組み込み,HASの発現ベクターであるHAS(-1,-2,3)-pCY4B-Neoを調整した。
2)各発現ベクターを,ヒト皮膚線維芽細胞のcell lineにDOTAP法によって導入した。数日ごとにNeomycinでselectionを行って,最終的にすべての細胞の染色体に,HAS遺伝子がstableに組み込まれたものになるまで細胞培養を繰り返した。
3)得た各細胞の培地を回収。培地中に分泌されるヒアルロン酸量を,カルバゾール硫酸法及びセルロースアセテート膜電気泳動等により解析した。その結果,HAS-1,-2,-3遺伝子の挿入された細胞の培地中には非常に高レベルでヒアルロン酸分泌量の上昇を確めた。
4)各HAS遺伝子がslableに導入されたもの及び導入されていない細胞からmRNAを抽出し,cDNAを調整した後,各細胞における遺伝子の発現動態をSerial analysis gene expression (SAGE)法によって解析する実験を開始,現在解析している。
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