アドレノメデュリン(AM)受容体の役割の解明および新規AM受容体の探索

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 14657255
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 江藤 胤尚 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (10038854)
• 研究分担者: 北村 和雄 宮崎医科大学, 医学部, 講師 (50204912)
• キーワード: アドレノメデュリン受容体 / negative regulator / mutant / cDNAライブラリー / 遺伝子導入 / 抗体 / アンチセンス / ラジオレセプターアッセイ

研究概要

1.AM受容体の機能を特異的に抑制する手段の確立(主として江藤胤尚が行う):
(1)AMの受容体結合を抑制する遺伝子の探索:本研究では、まずWister ratの肺からAM受容体の構成蛋白であるCRLRと2つのRAMP(RAMP2およびRAMP3)をPCR法を用いてクローニングした。現在、遺伝子導入効率の高いHEK-293細胞を用いて、2つのラットAM受容体(CRLR/RAMP2およびCRLR/RAMP3)の過剰安定発現系を作製中である。さらに、ラットのcDNAライブラリーをAMが豊富に発現している組織(まず主要な組織を選択)と発現していない組織に分けて作製中である。最近、内在性のAM受容体の機能を抑制するdominant-negative RAMPsをヒトに加えてラット(D93-99およびD58-64)でも同定した。
(2)AM結合に重要なRAMPの領域を認識する抗体の作製:AM結合に重要なヒトRAMPの領域(RAMP2;86番目から92番目の領域、RAMP3;59番目から65番目の領域)をウサギに免役して高力価のポリクローナル抗体を作製した。現在、これらの抗体を2つのヒトAM受容体の過剰安定発現系に投与し、ラジオレセプターアッセイを用いてAM結合の抑制効果を検討中である。
(3)AM受容体の蛋白合成を阻害するアンチセンスの作製:現在、内在性のヒトRAMP2やRAMP3の蛋白合成を特異的に阻害するアンチセンスのデザイン中である。
(4)2つのAM受容体の機能を選択的に抑制するdominant-negative CRLRの同定:CRLRと相同性のあるカルシトニン受容体とCRLRのキメラ蛋白を8つ作製した。現在、これらを用いて検討中である。
2.新規AM受容体の探索(主として北村和雄が行う):上記1の手段をすべて確立した後に、本研究を行う予定である。

研究成果

• [文献書誌] Kuwasako K, Kitamura K, Uemura T, Nagoshi Y, Kato J, Eto T: "The function of extracellular cysteines in the human adrenomedullin receptor"Hypertens.Res.. 26 Suppl. S25-S31 (2003)
• [文献書誌] Kuwasako K, Kitamura K, Nagoshi Y, Eto T: "Novel calcitonin-(8-32)-sensitive adrenomedullin receptors derived from co-expression of calcitonin receptor with receptor activity-modifying proteins"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 301(2). 460-464 (2003)
• [文献書誌] Nagoshi Y, Kuwasako K, Ito K, Uemura T, Kato J, Kitamura K, Eto T: "The calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying protein 1 heterodimer can function as a calcitonin gene-related peptide-(8-37)-sensitive adrenomedullin receptor"Eur.J.Pharmacol.. 450(3). 237-243 (2002)
• [文献書誌] Kuwasako K, Kitamura K, Onitsuka, H, Uemura T, Nagoshi Y, Kato J, Eto T: "Rat RAMP domains involved in adrenomedullin binding specificity"FEBS Lett.. 519(1-3). 113-116 (2002)