| 研究概要 |
ゼラチン処理したプレートにESQ feeder細胞を播種し培養した。1日後、mouse ES細胞を1x10^6cells/dishとなるようにfeeder細胞上に播種し、ES細胞を増殖させた。3日毎に、継代培養してES細胞を増殖させた。本年度の実験で、トリプシン・EDTA処理によってfeeder細胞の除外率やES細胞の回収率などに大きくばらつきができ分析結果が一定しないことが、あきらかになった。そのため、同処理を一定にするための様々な試みを行い、比較的安定した手技を確立することができた。そして、この培養系に、bFGF,TGF-βを様々な濃度と組み合わせで投与した。軟骨細胞への誘導を組織学的・組織免疫学的(type II collagen,s100蛋白)を指標として検索したところ、極一部に軟骨細胞様の所見を呈する細胞群を見つけた。しかし、明らかな軟骨細胞への分化は確認できず、この検索方法では効率よく分化条件を比較して軟骨誘導条件を決定することはできないと結論した。つまり、蛋白レベルで検索できるほど十分な軟骨分化を誘導できていなかった。もちろん、type II collagenやs100蛋白が確認できる場合があることから、必ずしも誘導因子が不足しているとは結論できず、分化阻害因子の存在も考慮しなければならなかった。
そこで次年度は、比較的繰り返しが容易なmRNAでの検索、つまりRT-PCR(type II collagen,aggrecan)を主な方法とする予定である。さらに、BMP2を加えて分化を誘導する。また、SCIDマウスの生体内に移植し、in vivoでの組織誘導にまで進めたい。そして、type II collagen,aggrecanのmRNA expressionという指標から、最も軟骨分化に適していると考えられる条件を決定する。分化誘導の効果判定もさらに増やし、RNA抽出後に、軟骨・骨形成に関与するとされているBMP/Noggin/Chordin/cbfa-1/CDMP-1/GDF-5などについても順次検索する。また、軟骨分化に適した条件でも、一部の細胞は筋や脂肪にも分化すると考えられるため、それらの指標についても調査する予定である。
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