| 研究概要 |
本研究の目的は数十から数百キロのDNA断片を容易にクローニングする新しい染色体工学的手法を確立することである。このため1)テロメアベクターのターゲティングと2)光架橋プライマーによる常温ポリメラーゼ伸張、による目的の領域の長断片DNAの増幅を試みた。
(1)テロメアベクターの試作
テロメアー繰り返し配列を1Kbもったベクターにこの領域内に存在するD1S437、D1S459それぞれのSTSマーカーをプライマーとしてPCRで増幅したDNA断片(5Kb)を組み込んだ。homologous recombinationの頻度の高いchikenDT40細胞にヒト1番染色体を導入したうえでこのベクターをターゲッティングすることにより、特定のSTSマーカーより遠位側と近位側の欠失をもった1番染色体断片を作製し得るかどうか検討した。テロメアー繰り返し配列の効果的な長さは1Kbでよいのか否か等についても検討を行った。現在のところ1kbベクターでSTSマーカーより遠位側の欠損を持った染色体断片が5-10%の頻度で得られているが、より長いテロメアのほうが効率的に目的の断片を得られる可能性もあるため2、3,4kbのベクターも作製した。これらについても同様の検討を行う予定である。
(2)光架橋プライマーによる増幅
D1S437、D1S459それぞれのSTSプライマーをpsoraren付着型で合成した。ヒト1番染色体をもつマウスA9細胞よりDNAを抽出し、変性した後これらのプライマーをアニールさせた。その後長波長紫外線で処理しプライマーをDNAに架橋し強固に固着させた。これをDNA polymeraseで処理しプライマー間を伸長させる試みを行ったが、効率的な伸長が得られずpolymeraseの種類、反応条件を再検討する予定である。
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